福寿螺多糖免疫调节作用研究

赵东贤，胡命宝，王 军

1.淮南联合大学(安徽淮南232001)

2.淮南市第一人民医院(安徽淮南232001)

福寿螺又名苹果螺，产于南美洲亚马逊河流域。属软体动物门，瓶螺科，瓶螺属，在我国资源极为丰富。现代研究表明贝类多糖具有抗肿瘤，增强机体免疫力，抗衰老，抗病毒等功能［1］。前期实验证实福寿螺多糖具有抗病毒生物学活性［2］，其作用机制可能与提高机体免疫力有关，而关于福寿螺多糖增强免疫活性的研究未见报道。本研究旨在系统探讨了福寿螺多糖对小鼠免疫功能的影响，为福寿螺多糖药用学价值的开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、药品、试剂与仪器 昆明种标准小鼠，体质量18～22 g，雌雄各半，安徽医科大学提供(SPF级，许可证号:SCXK(皖)2011－002)。福寿螺多糖由安徽理工大学病原微生物实验室提供，纯度为91.4%;小牛血清，美国GIBCO公司;MTT检测试剂盒，北京碧云天公司;刀豆蛋白A，Sigma公司;LDH测定试剂盒，南京建成生物工程研究所;其它试剂为国产分析纯。AE－20型电子分析天平，瑞士Metller公司;721－w微机型分光光度计，上海第三分析仪器厂;CO2孵箱，三洋电机国际贸易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠免疫脏器指数的测定 昆明种标准小鼠40只小鼠随机分为4组(每组10只):蒸馏水对照组、福寿螺多糖低、中、高剂量组(50、100、200 mg/kg)。每天定时等体积灌胃1次，连续给药30 d后，禁食2 h，称量每只小鼠体质量。颈椎脱臼处死，摘取胸腺和脾脏，吸干血迹，称重，计算胸腺、脾脏指数［2］。

1.2.2 吞噬细胞吞噬功能检测 动物分组、给药同1.2.1。实验当天，小鼠腹腔注入5%的鸡红细胞悬液0.5 mL/只，2 h后腹腔注射2 mL生理盐水，将小鼠颈椎脱臼处死，轻揉小鼠腹部2 min，吸出腹腔液置于含肝素钠的离心管混匀(同组小鼠腹腔液放入同一管中)。取0.1 mL涂片，每组重复做片5片。将载玻片置于37℃培养箱孵育30 min，漂洗去上清液和未粘附的细胞，自然干燥后瑞氏染色，油镜下随机观察200个巨噬细胞，计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数，计算吞噬指数［3－4］。

1.2.3 免疫抑制小鼠血清溶血素水平的测定 取小鼠50只，随机分为空白对照组、模型对照组(环磷酰胺)、福寿螺多糖低、中、高剂量组(每组10只)。空白组与模型组给予等体积蒸馏水，其他组给予多糖灌胃30d，并于第27、28、29d对小鼠(除空白对照组)腹腔注射环磷酰胺20mg/kg，在首次给药第28 d各组小鼠均腹腔注射5%的鸡红细胞悬液0.2 mL致敏。末次给药30 min后，眼眶取血，离心20 min取血清，用生理盐水1∶50稀释后取1 mL，与5%鸡红细胞混悬液0.5 mL和10%豚鼠补体0.5 mL混匀，37℃水浴30 min，冰水中止反应10 min，离心取上清液于540 nm 处比色［5－6］。

1.2.4 小鼠淋巴细胞增殖 动物分组、给药同

1.2.1 ，无菌操作分别取小鼠脾脏、胸腺，过200目钢丝筛网，制备单细胞悬液，离心10 min，Hank’s液洗涤，将细胞悬浮于1 mL的完全培养液中。活细胞数在95%以上，细胞密度为5×105个/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔0.1 mL，每组6复孔。每组3孔加10 μg/mL的 ConA 100 μL/孔为实验组，其余3孔加RPMI1640培养液100 μL/孔为对照组，置于含5%CO2，37℃培养箱培养72 h，加入5 mg/mL的MTT20μL。继续培养4h，吸去上清液，加入 DMSO100 μL/孔，振荡 10 min，酶标仪 570 nm 波长测每孔OD值，算出吞噬细胞刺激指数［4－5］。刺激指数=实验孔OD均值/对照孔OD均值。

1.3 数据处理 采用 SPSS13.0软件进行数据分析，对数据进行单因子方差分析，对组间比较进行t检验，数据用均值±标准差(±s)形式表示，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 对小鼠脏器指数、巨噬细胞吞噬作用的影响福寿螺高剂量组小鼠的脾脏指数明显高于正常对照组(P＜0.05)。各剂量组小鼠胸腺指数与正常对照组小鼠胸腺指数相比无明显差异性。中、高剂量组小鼠吞噬细胞的吞噬百分率、吞噬指数分别与对照组比较差异显著(P＜0.05)。见表1。

表1 福寿螺多糖对小鼠脏器指数和吞噬细胞吞噬功能的影响(n=10(±s)

表1 福寿螺多糖对小鼠脏器指数和吞噬细胞吞噬功能的影响(n=10(±s)

注:与对照组比较，▲P ＜0.05，★P ＜0.01。

吞噬指数正常对照 —组别 剂量(mg/kg) 脾脏指数(mg/g) 胸腺指数(mg/g) 吞噬百分率(%)3.81 ±1.83 2.93 ± 0.59 25.82 ±2.13 0.35 ±0.05福寿螺多糖组 50 3.93 ±1.23 3.12 ±0.85 25.24 ±1.85 0.34 ±0.01福寿螺多糖组 100 4.08±0.56 2.96±1.27 30.12±3.41▲ 0.42±0.03▲福寿螺多糖组 200 4.53±2.11▲ 3.27 ±1.53 45.03±2.56★ 0.50±0.05★

2.2 对免疫抑制小鼠溶血素抗体水平及ConA诱导淋巴细胞增殖反应的影响 模型组与正常对照组相比，模型组小鼠溶血素吸光度明显降低(P＜0.05)。福寿螺中、高剂量组小鼠溶血素吸光度A值与模型组相比差异性显著(P＜0.05，P＜0.01)。福寿螺中、高剂量组ConA诱导的脾淋巴细胞刺激指数与模型组相比有差异性(P＜0.05)。但各个剂量组对于ConA诱导的胸腺淋巴细胞增殖与模型组无明显差异性。见表2。

表2 福寿螺多糖对小鼠血溶素抗体和淋巴细胞增殖反应的影响(n=10(±s)

表2 福寿螺多糖对小鼠血溶素抗体和淋巴细胞增殖反应的影响(n=10(±s)

注:与正常对照组比较，●P ＜0.05;与模型组比较▲P ＜0.05，★P ＜0.01。

脾淋巴细胞刺激指数 胸腺淋巴细胞刺激指数正常对照组 —组别 剂量(mg/kg) 血清素水平(A值)0.23 ±0.01 1.09 ±0.03 1.01 ±0.02模型对照组 — 0.10±0.02● — —福寿螺多糖组 50 0.11 ±0.03 1.10 ±0.02 1.02 ±0.01福寿螺多糖组 100 0.16±0.02▲ 1.25±0.04● 1.01±0.03福寿螺多糖组 200 0.20±0.06★ 1.37±0.03●1.04 ±0.05

3 讨论

机体的免疫系统由特异性免疫和非特异性免疫构成。实验结果显示高剂量福寿螺多糖可提高小鼠脾脏指数，但各剂量组对胸腺指数影响不大。脾脏中有丰富的B淋巴细胞和巨噬细胞，与体液免疫关系更为密切，其脏器指数可在一定程度上反映机体免疫功能的强弱。表1结果还显示，中、高剂量的多糖均能显著提高腹腔巨噬细胞的吞噬百分率、吞噬指数，且200 mg/kg浓度时增强作用达到极显著的水平(P＜0.01)，而单核巨噬细胞系统是机体非特异性免疫系统的重要组成部分，具有吞噬和杀伤病原微生物、处理提呈抗原、分泌细胞因子的能力。表2结果显示，模型组与对照组比较，血清素水平明显降低，说明造模成功，模型组与多糖组比较，中、高剂量多糖组对免疫抑制小鼠血溶素水平有明显修复作用，尤其高剂量多糖组溶血素抗体水平修复接近于正常组。表明多糖能显著提高免疫抑制小鼠的免疫功能。研究结果还显示福寿螺多糖对脾淋巴细胞的增殖反应呈现上抛物线形式的增强，其中100 mg/kg、200 mg/kg浓度时增强作用达显著水平(P＜0.05)，表明多糖灌胃30 d后，增加小鼠体内辅助性T细胞和诱导性T细胞数量，同时减少了抑制性 T细胞的数量、减弱其功能，从而使小鼠的免疫应答反应增强。由此可见，多糖对机体的免疫功能的增强作用与其提高小鼠脾脏指数、腹腔巨噬细胞的吞噬能力、有效激活免疫细胞、促进相关细胞因子的分泌有关。说明在增强机体免疫功效方面，福寿螺多糖具有广阔的开发前景。

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