应用MGB探针检测人丙型肝炎病毒的基因型

陈泽惠，李欣钰，肖湘文，丁 渭，刘淑园，陈华云*

1.云梦县人民医院输血科(湖北云梦432500)

2.中山大学达安基因诊断中心(广东 广州510120)

丙型肝炎病毒(HCV)是具有高度的多样性、异源性及非均一性变异特点的RNA病毒［1］，可经血液传播引起肝脏病变，是造成慢性肝炎、肝硬化、原发性肝癌［2］的主要原因。由于该病毒基因组序列的高度变异性致使HCV分为6个基因型及多种不同的亚型［3］，且 HCV 基因型具有区域分布特征［4］。有研究报道，人类感染HCV后的临床病程及治疗效应与其基因型之间存在一定的相关性，因此，对HCV感染者的血清或血浆先进行分型分析，能为临床治疗起到重要的指导作用［5－6］，也对疫苗的研制提供重要的参考。本研究利用MGB探针的实时荧光定量PCR体系对HCV病毒进行基因分型的检测，并对该检测体系进行了敏感性、重复性、特异性等方法学评价，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 样本 乙型肝炎病毒样本、艾滋病毒样本、EB病毒样本、人类疱疹病毒样本等来自广州地区医院。检测对象为700例阳性样本，分别为来自湖北省人民医院、北京302医院、北京地坛医院、昆明3院四家医院搜集的血清或血浆样本，及广州地区医院250例体检者的血液样本。

1.2 试剂和仪器 RNA提取试剂盒采用中山大学达安基因股份有限公司的核酸提取试剂盒(离心柱法)，PCR buffer、热启动 Taq酶、C－MLV 酶等为达安公司提供，dNTP、RNasin抑制剂、T载体试剂盒、T4连接酶试剂盒购自Promega。实验仪器为ABI 9700 PCR仪、ABI 7500荧光定量PCR仪。

1.3 引物及探针设计 根据NCBI中HCV的基因组序列，选取HCV基因组中型特异性碱基的聚集区域为靶区域，在此区域内应用Primer5.0设计特异的引物及探针以区分不同的型别，探针5’报告基团分别用FAM标记、Yellow标记、TexasRed标记，3’荧光淬灭基团用Eclipse标记。引物及探针由达安和生工合成。引物及探针序列如表1所示。

1.4 样本提取 采用中山大学达安基因股份有限公司核酸提取试剂盒(离心柱法)从200 μL血清或血浆中提取病毒RNA，具体的提取操作步骤严格按照说明书进行。提取得到的RNA，－80℃保存备用。

1.5 实时荧光定量PCR反应 将HCV的8个基因型分为A管、B管、C管，其中A反应管包括2a型、3b型及内标;B反应管包括1b型、1a型、2b型;C反应管包括6a型、3a型、6v型。实时荧光定量PCR 的反应体系共 50 μL，其中 RNA 模板 20 μL，HCV 分型酶系3μL，5×PCR buffer 10μL，HCV 不同型别的引物及探针混合物6 μL，灭菌水11 μL。反应条件为:50℃15 min(RNA反转录成cDNA);95℃15 min(灭活逆转录酶及激活热启动Taq酶);94℃变性15 s，58℃45 s(收集荧光)，共45个循环。PCR反应在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行。

表1 HCV基因分型引物及探针序列

1.6 阳性质控品的制备 首先对各型别进行PCR扩增，而后进行基因克隆，将克隆正确的菌液，提取质粒后制作病毒样颗粒，测序均由上海英俊公司完成。

1.7 特异性检测 采用核酸提取试剂盒(离心柱法)提取的乙型肝炎病毒、艾滋病毒、EB病毒、人类疱疹病毒等样本中的病毒核酸，利用荧光定量PCR－MGB探针基因分型检测试剂盒进行检测。

1.8 灵敏度检测 将各型别的病毒样颗粒梯度稀释，每个浓度分别检测10次，检测结果与HCV国家标准品进行比较，确定试剂盒的灵敏度。

1.9 临床样本的检测 将700例阳性样本和250例体检者的血液样本进行MGB探针法的荧光定量PCR基因分型检测，对检测结果进行统计分析。

2 结果

2.1 阳性质控品构建结果 首先对各型别的PCR产物进行基因克隆，克隆测序结果正确后进行病毒样颗粒表达载体的构建，而后将重组的病毒样颗粒的测序结果与NCBI中的基因序列进行比对，结果正确。对测序正确的重组病毒样颗粒进行诱导，诱导成功，表明阳性质控品构建成功。

2.2 特异性检测 将提取的乙型肝炎病毒、艾滋病毒、EB病毒、人类疱疹病毒等样本中的病毒核酸利用MGB探针的荧光定量PCR体系进行检测，结果全部为阴性，无扩增曲线，仅阳性质控品产生相应型别的扩增曲线。

2.3 灵敏度检测结果 将阳性质控品与HCV国家标准品进行梯度稀释后，应用MGB探针的荧光定量PCR基因分型体系进行扩增，通过与国家标准品进行对比，确定本试剂盒的灵敏度为100 IU/mL，Ct值位于35～37范围内。(阳性质控品扩增曲线如图1所示)。

图1 阳性质控品梯度扩增曲线

2.4 临床样本检测结果 250例体检者血液中检测到阳性病例8例，将8例阳性样本进行PCR扩增后测序，结果全为阳性。已知的700例阳性样本经MGB探针的荧光定量PCR体系检测，检测结果全为阳性，基因型大多数为1b型、2a型和3b型，少量的3a型和6a型，极少量的1a型和6v型。临床试验结果显示，本试剂盒的灵敏度为100%，特异性为99.42%，粗一致性为99.73%，对血清和血浆两种类型样本检测结果无差异。

3 讨论

有研究报道，HCV基因型分布不仅具有地域特性［7］，而且感染不同的基因型，可能导致临床特征存在差异，因此HCV基因型是分析肝细胞癌患者的病因的重要因素。本研究以HCV 2a型、3b型、1b型、1a型、2b型、6a型、3a型、6v型 7个常见亚型为研究对象，采用MGB探针的荧光定量PCR体系对血液或血清及血浆中的HCV病毒进行初步的型别检测，辅助临床进行初步诊断，为找到快速的治疗方案及寻找HCV的传播途径提供帮助，也为病原体的来源提供依据，因此对HCV基因型的研究十分重要。

目前研究HCV基因分型的方法常用的有引物特异性电泳分型法、分管引物测序法、HPLC酶切法、熔点曲线法、荧光PCR法等，这些传统的方法操作步骤复杂，耗时较长，而且结果不稳定。为了快速准确的对HCV病毒进行基因型的确定，本研究采用MGB探针的荧光定量PCR体系进行检测。MGB探针具有以下优点:(1)序列设计简单;(2)可以提高序列的Tm值，并可准确预测Tm值;(3)高灵敏度，可以较早侦测到荧光信号;(4)更快速辨识目标序列;(5)高特异性，而且适用于多种反应体系等。由于MGB探针的诸多优点，因此可以提高HCV病毒基因分型时的准确度、特异性和灵敏度等。相对于传统的荧光定量PCR方法，MGB探针的荧光定量PCR方法在检测HCV RNA病毒时灵敏度可达到100 IU/mL。

综上所述，在检测病毒基因型方面，荧光定量PCR法是重要的检测方法，且此方法的检测结果在对病毒进行初步分析时也具有一定的意义。本研究通过利用MGB探针的荧光定量PCR检测体系对HCV病毒进行检测，大大提高了荧光定量PCR法在检测HCV病毒时的灵敏度和效率，并且可以方便快速的检测HCV病毒的基因型，为以后研究HCV的发病机理和治疗提供有益的帮助。

［1］ 来家骐，建朝.丙型肝炎病毒基因变异与临床［J］.河北医药，2001，23(5):323－325.

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［3］ Simmonds P，Jens Bukh，Christophe Combet，et al.Consensus proposals for a unified system of nomenclature of hepatitis C virus genotypes［J］.Hepatology，2005，42(4):962－73.

［4］ 张帆，王小红，王宇明，等.重庆地区HCV基因亚型的分布状态［J］.第四军医大学学报，2005，26(14):1253－1256.

［5］ Zeuzem S，Berg T，Moeller B，et al.Expert opinion on the treatment of patients with chronic hepatitis C［J］.J Viral Hepat，2009，16(2):75－90.

［6］ Lee C M，Hung C H，Lu S N，et al.Hepatitis C virus genotypes:clinical relevance and therapeutic implications［J］.Chang Gung Med J，2008，31(1):16－25.

［7］ Bellentani S，Miglioli L，Masutti F，et al.Epidemiology of hepatitis C virus infection in Italy:the slowly unraveling mystery［J］.Microbes and Infection，2000，2(14):1757－1763.