腺病毒介导miRNA－138抑制人胃癌BGC－823细胞增殖的机制研究＊

范亚川，梁光萍，陈先华，胡春燕，邹利全，李学成，陈 陵△

（1.中国人民解放军三二四医院消化内科，重庆400020；2.第三军医大学西南医院烧伤研究所，重庆400038；3.第三军医大学新桥医院肿瘤生物治疗中心，重庆400037）

胃癌是全球肿瘤中发病率、致死率最高的肿瘤之一，传统手术、化疗及放疗疗效欠佳［1］，5年生存率不到30%［2］，因此需要深入研究胃癌发病机制并开发新的治疗模式［3］。随着miRNA（miR）的功能的揭示，miRNA 在肿瘤早期诊断［4］及治疗［5］中的作用日益受到重视。笔者在前期研究中发现，miR－138在胃癌进展过程中呈逐步下降趋势，且其表达与hTERT呈负相关［6］，而hTERT 可促进胃癌发生、发展［7－8］。国外有研究亦发现，miR－138可通过抑制甲状腺癌内hTERT蛋白表达而抑制甲状腺癌细胞生长［9］。在成功包装负载miR－138的腺病毒［10］基础上，本研究拟进一步探讨miR－138过表达对人胃癌BGC－823细胞增殖及侵袭能力的影响及可能的作用机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 人胃癌BGC－823细胞株（中科院上海生科院细胞资源中心），DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）及胰蛋白酶（HyClone），负载有miR－138表达序列的复制缺陷型腺病毒（Ad－miR138），由本室构建并保存［10］；负载有β－半乳糖苷酶（β－gal）基因LacZ的复制缺陷型腺病毒，由西南医院心内科唐兵博士惠赠。mirVanaTMmiRNA提取试剂盒（Ambion），逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq试剂盒（TaKaRa）；ABI7500荧光定量PCR仪（ABI）；CCK－8检测试剂盒（碧云天）；Transwell小室（Corning）。

1.2 方法

1.2.1 BGC－823细胞培养 采用含10%FBS的高糖DMEM培养液，置37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 Ad－miR138感染人胃癌细胞BGC－823 取对数生长期的BGC－823细胞接种于6孔细胞培养板中，以PBS代替腺病毒作为空白对照（BGC－823组）；感染 Ad－LacZ的阴性对照（BGC823－AdLacZ组）；感染 Ad－miR138的BGC823－AdmiR138组。腺病毒感染步骤参照文献［10］进行。感染后48h收集各组细胞用于后续实验。

1.2.3 实时定量－聚合酶链反应（RT－PCR）检测miR－138表达提取细胞miRNA，逆转录cDNA，配好RT－PCR反应体系后，于ABI7500荧光定量PCR仪上进行PCR反应，退火温度为60℃。相对定量采用2－△△CT进行计算，引物序列见表1。

1.2.4 CCK－8方法检测胃癌细胞增殖 感染腺病毒48h后收集各组细胞，以每孔2.5×103个细胞，接种于96孔板中，共检测6次，每天1次，每个时间点设置3个复孔。检测前每孔分别加入20μL CCK－8试剂，避光37℃孵育2h，轻轻振荡后，酶标仪测定450nm波长处吸光度（A）值，并比较各组细胞的A值，观察miR－138对胃癌细胞增殖的影响并计算抑瘤率。抑瘤率＝（1－实验组A值／对照组A值）×100%。

表1 RT－PCR及PCR引物列表

1.2.5 Transwell小室检测胃癌细胞侵袭能力 感染腺病毒48h后收集各组细胞，用无血清的DMEM培养液悬浮细胞，稀释成1×105mL－1的细胞密度，加入200μL细胞悬液至Transwell上室，下室加入800μL的含10%血清的DMEM培养液，37℃孵育24h后，乙醇棉球拭去上室未迁移细胞，经95%乙醇固定后，1%结晶紫染色3min。采用显微镜观察细胞迁移情况，实验重复3次。随机取5个200倍视野，计数侵袭的细胞，取平均值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 RT－PCR 检测 Ad－miR138感染 BGC－823细胞后 miR－138的表达 与BGC823－AdLacZ组相比，BGC823－AdmiR138组细胞内miR－138表达丰度显著上调（1.07±0.07 vs.4.89±0.45），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 CCK－8检测细胞生长曲线 采用CCK－8检测细胞生长曲线。与对照组相比，BGC823－AdmiR138组细胞增殖受到明显抑制。在第5、6天，BGC823－AdmiR138组A值显著低于对照组（5d：0.41±0.04 vs.0.65±0.08；6d：0.52±0.06 vs.0.77±0.06），第5、6天抑瘤率分别为36.9%、32.5%。

2.3 Ad－miR138感染对胃癌BGC－823细胞侵袭能力的影响与BGC823－AdLacZ组相比，Ad－miR138实验组细胞侵袭能力显著下降（56±12 vs.32±11），差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图1 CCK－8检测BGC－823细胞生长曲线

图2 Transwell小室检测胃癌细胞侵袭能力

3 讨 论

新近研究发现，miR－138是一重要的抑癌miRNA，可通过靶向多个癌基因抑制肿瘤生长，例如在肝癌细胞株内miR－138功能模拟物可抑制靶基因CCND3而在体外及小鼠体内抑制肝细胞癌的生长与转移［11］。miR－138还可通过 BCR－ABL／GATA1／miR－138环路，抑制慢性髓样白血病细胞株增殖，促进其凋亡［12］。还有研究发现，在肾透明细胞癌细胞株786－0内，miR－138可抑制靶基因HIF－1α表达而促进肾癌细胞凋亡并抑制其侵袭能力［13］；并且，miR－138还可通过抑制其靶基因P－糖蛋白，Bcl－2以及多种耐药基因－1，逆转白血病细胞株 HL－60的耐药性［14］。这些结果表明，miR－138是一个重要的抑癌miRNA。笔者前期研究亦发现，转染 miR－138功能模拟物RNA后，人胃腺癌细胞株SGC－7901增殖能力显著抑制［15］。由于miR－138功能模拟物RNA易降解，作用时间短。

本研究采用Ad－miR138感染人胃癌BGC－823细胞株，发现Ad－miR138可明显上调细胞内miR－138表达丰度，并显著抑制BGC－823细胞的增殖及侵袭能力。因此，以抑癌miR－138作为胃癌治疗靶标的策略是可行的。并且，由于miR－138可通过多种机制抑制肿瘤生长与增殖，并可逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药性［14］，因此极可能成为优良的抗肿瘤治疗靶标。

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