缩宫素对大鼠心肌缺血再灌注后一氧化氮及内皮素－1的影响

牛少辉，张丽华，刘旭邦，陈 杰

（郑州大学第二附属医院心血管内科，郑州450014）

对缺血心肌施行再灌注治疗是缺血性心脏病的主要治疗方法之一，缺血再灌注在拯救缺血心肌的同时还会造成心肌的缺血再灌注损伤（ischemic／reperfusion，I／R），加重单纯心肌缺血所造成的损伤，成为影响疗效的一个重要因素。目前研究发现，与女性生殖相关的催产素（oxytocin，OT）在心血管系统中也起着新的作用，同时在大鼠、人类的心脏以及血管床中已经发现了有功能的OT受体［1］。多项研究也表明，I／R与一氧化氮（NO）、内皮素－1（ET－1）有密切关系。但是，OT保护心肌防治I／R机制还未明确。本实验通过建立大鼠心脏I／R模型，观察OT对I／R心肌组织中NO、ET－1表达的影响，探讨其对心肌I／R的保护作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠，体质量250～300g（郑州大学实验动物中心提供，批号：410118）。OT注射液每支1mL（上海典微生物技术有限公司，批号：H34022979）。实验仪器：Hx－100E小动物呼吸机（自成都豢肇科技公司）。

1.2 大鼠心肌I／R模型制作及分组 取雄性SD大鼠80只，分为I／R组、I／R＋OT组、假手术组（SH组）和健康对照组（N组），每组20只。4组大鼠适应性喂养1周，术前12h禁食。SH组、I／R组和I／R＋OT组用质量分数为10%的水合氯醛（0.3mL／100g）腹腔麻醉后固定于操作台，胸部去毛，消毒，气管切开，机械辅助通气，沿胸骨左缘开胸，暴露心脏，环绕左冠状动脉前降支根部穿线，结扎，以盐水纱布覆盖，25min后剪开结扎线，使心肌再灌注，120min后结束实验。线结扎左冠状动脉前降支致心肌缺血，去除结扎线致心肌再灌注，仅穿线而未结扎者为SH模型。以心电图和心肌颜色改变作为缺血再灌注造模成功的标志：结扎左冠状动脉前降支后见心电图ST段立即抬高，局部心肌颜色由红变灰；再灌注时抬高的ST段回落50%以上，心肌颜色变红。I／R＋OT组大鼠于术前25 min腹腔注射缩宫素0.03μg／kg，其余3组分别给予相同剂量生理盐水腹腔注射［2］。

1.3 指标测定 再灌注结束后，取大鼠腹主动脉血4mL，静置60min后，3 000r／min，离心5min，吸取上层血清，保存在－70℃的冰箱中。分别以化学法和放射免疫法测定血清NO、血浆ET－1值，并计算NO／ET－1比值；全自动生化分析仪检测血清肌酸激酶同工酶（CK－MB）、乳酸脱氢酶（LDH）。所有操作均按照试剂盒说明进行操作。

1.4 组织形态分析 再灌注结束后，将大鼠颈椎脱臼处死，48 h内取左心室前壁心肌梗死区为标本。在10%甲醛溶液中固定，常规脱水，石蜡包埋，6μm连续切片，分别做HE染色、显微镜检查。

1.5 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料以表示，组间 NO、ET－1、CK－MB和LDH 水平采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD－t法；相关分析采用Pearson分析，检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HE染色结果 SH组和N组心肌切片中，可见心肌纤维排列整齐，有分支，细胞核染色清晰，核位于肌纤维中轴部分，未见细胞变性和坏死。I／R组心肌纤维排列不规则，心肌纤维水肿、断裂，肌浆内空泡形成，肌浆溶解，心肌间质水肿，较多粒细胞灶状浸润，及见小灶性出血，I／R＋OT组可见心肌细胞排列、间质水肿及粒细胞浸润程度介于N组与SH组，见图1。

图1 各组大鼠心肌组织结构变化（HE×400）

2.2 血清 CK－MB、LDH 的变化 与SH 组相比，I／R组和I／R＋OT组血清中心肌酶CK－MB、LDH均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），而N组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；I／R＋OT组血清中心肌酶CK－MB、LDH水平较I／R组低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 OT对大鼠心肌I／R后CK－MB、LDH的影响±s，U／L）

表1 OT对大鼠心肌I／R后CK－MB、LDH的影响±s，U／L）

＃：P＜0.05，与SH组比较；＊：P＜0.05，与I／R组比较。

CK－MB LDH SH组 20 174.6±65.3＊ 935.5±245.7组别 n＊N组 20 141.2±73.4＊ 824.9±197.5＊I／R组 20 2 368.4±605.1＃ 2 047.2±421.4＃I／R＋OT组 20 1 523.7±387.9＃＊ 1 499.7±405.8＃＊

2.3 血清 NO和ET－1的变化 与SH 组相比，I／R组和I／R＋OT组血清中NO水平均降低、ET－1水平均升高，差异有统计学意义（P＜0.05），而在N组的表达差异无统计学意义（P＞0.05）；给予OT干预后均可明显增加NO水平，降低ET－1水平与I／R组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 OT对大鼠心肌I／R后NO和ET－1的影响±s）

表2 OT对大鼠心肌I／R后NO和ET－1的影响±s）

＃：P＜0.05，与SH组比较；＊：P＜0.05，与I／R组比较。

组别 n NO（μmol／L） ET－1（pg／mL）SH组 20 40.7±6.1＊ 83.32±12.47＊N组 20 56.8±3.4＊ 68.54±17.2＊I／R组 20 19.9±3.8＃ 187.29±41.51＃I／R＋OT组 20 36.7±3.4＃＊ 141.71±25.84＃＊

2.4 相关性分析 对各组NO、ET－1水平分别用SPSS绘图功能做散点图，并进行Pearson相关性分析：I／R组NO、ET－1水平呈负相关（r＝－0.762，P＜0.05）；I／R＋OT组 NO、ET－1水平呈负相关（r＝－0.607，P＜0.05）。N组和SH组无明显相关性。

3 讨 论

有研究发现，除了下丘脑和大脑的其他部位，心脏也可以合成和释放OT，应用放射免疫分析法可以在心脏的4个腔室中检测到OT的存在。同时，在心房、心室和血管内皮细胞中都发现了OT受体［1］。Gutkowska等［2］研究表示，OT是一种心血管激素，通过诱导ANP的释放对心血管有重要作用。Dusunceli等［3］研究发现，在大鼠肝脏的缺血再灌注中，OT可以刺激NO的释放，保护缺血组织。Tugtepe等［4］研究证实，在大鼠肾脏I／R模型中OT也可以刺激NO的释放，保护肾功能［5］。在 OT对心肌I／R损伤的研究中，Alizadeh等［5］发现，在心肌细胞中OT通过激活的线粒体KATP通路对心肌起保护作用，但是OT与心肌缺血再灌注密切相关的NO、ET－1的关系还未报道。

内皮源性NO是内皮细胞产生的舒张血管的强大物质，多数研究表明，在急性心肌缺血再灌注时，心肌发生不同程度的心肌损伤，这与血浆NO含量下降有关［6－7］。在缺血再灌注预处理过程中，NO对缺血再灌注损伤具有调节和保护作用。Wink等［8］实验表明，NO具有抗氧化作用，它把培养的肺成纤维细胞及神经元暴露于过氧化生成体系中，发现细胞损伤存在剂量依赖性；而在其中加入NO供体后，细胞损伤显著减轻。心肌再灌注伴过氧化物的大量产生，因而提前加入NO供体有利于细胞的保护。ET是一种强大的缩血管物质，具有收缩冠状血管、降低心率等作用。目前发现人的ET有3种，主要由血管内皮细胞产生，其中ET－1的生物活性最强，收缩血管的作用最为强烈。心肌缺血再灌注可以导致ET数量增加，尤其在灌注期增加的更加迅猛，有可能是缺血再灌注导致内皮细胞稳态失衡的结果，研究发现，ET转换酶抑制剂PP36可以保护急性心肌缺血大鼠的心功能［9］。正常情况下，血管内皮释放一定量的 NO、ET－1，NO舒张血管，ET－1收缩血管，二者的动态平衡调节着血管的舒缩［10－11］。心肌缺血缺氧，内皮功能障碍，对周围环境的反应性减弱，NO的释放量减少和生物活性下降，NO和ET对血管的效应相反，是相互拮抗的关系，NO释放减少，收缩血管的ET－1释放水平就会急剧上升，NO／ET－1失调，二者的平衡被破坏，这些原因导致冠状动脉收缩，血流减少，流速减慢，中性粒细胞在内皮细胞上聚集，释放各种介质和氧自由基，心肌缺血缺氧加剧［12］。

本实验结果显示，I／R组CK－MB、LDH及光镜下心肌组织的改变，均反映心肌缺血坏死较重，提示造模成功；I／R＋OT组CK－MB、LDH水平明显下降，光镜下心肌组织改变较I／R组轻，提示OT可能对心肌I／R损伤有保护作用。与SH组相比，I／R组和I／R＋OT组血清中 NO水平均降低、ET－1水平均升高（P＜0.05），而在N组的表达差异无统计学意义（P＞0.05）；血清中NO降低的水平、ET－1升高的水平在I／R组较I／R＋OT组高（P＜0.05）；NO、ET－1的表达水平呈负相关。提示心肌I／R后NO水平降低、ET－1水平升高，可能是导致心肌损伤的重要病理生理机制，机制可能是血管收缩，血流减少，流速减慢，中性粒细胞在内皮细胞上聚集，释放各种介质和氧自由基，进而损伤心肌。I／R＋OT组血清中NO水平较I／R组高、ET－1水平较I／R组低，提示OT对心肌I／R损伤有保护作用，其机制可能是在缺血缺氧状态下，血管内皮损伤引起内皮功能障碍，影响了NO的分泌合成，ET－1水平升高，OT可以在一定程度上纠正内皮功能紊乱，使NO的分泌释放量有所升高，ET－1水平有所下降，血管相对收缩减轻，缓解了心脏缺血缺氧状态。NO、ET－1水平表达呈负相关，提示NO和ET－1在心肌I／R后损伤的发生中可能起协同作用。

综上所述，心肌I／R后OT可能通过改善受损内皮的功能，调节血管活性物质的分泌、释放及不同物质间的比例，使下调的NO／ET－1趋于正常、恒定，以调节血管紧张度和局部血流量，恢复血管的自稳态，可能为I／R后心肌损伤的治疗开辟了新的领域，值得进一步研究。

［1］Gutkowska J，Jankowski M.Oxytocin Revisited：Its Role in Cardiovascular Regulation［J］.J Neuroendocrinol，2012，24（4）：599－608.

［2］Gutkowska J，Jankowski M，Mukaddam－Daher S，et al.Oxytocin is a cardiovascular Hormone［J］.Braz J Med Biol Res，2000，33（6）：625－633.

［3］Dusunceli F，Iseri SO，Ercan F，et al.Oxytocin alleviates hepatic ischemia－reperfusion injury in rats［J］.Peptides，2008，29（7）：1216－1222.

［4］Tugtepe H，Sener G，Biyikli NK，et al.The protective effect of oxytocin on renal ischemia／reperfusion injury in rats［J］.Regul Pept，2007，140（3）：101－108.

［5］Alizadeh AM，Faghihi M，Sadeghipour HR，et al.Oxytocin protects rat heart against ischemia－reperfusion injury via pathway involving mitochondrial ATP－dependent potassium channels［J］.Peptides，2010，31（7）：1341－1345.

［6］Cohen MV，Yang XM，Downey JM.Nitric oxide is a preconditioining mimetic and cardioprotectant and is the basis of many available infartctsparing strategies［J］.Cardiovasc Res，2006，70（2）：231－239.

［7］贾俊海，陈素仙，陈永昌.缺血预处理对心肌缺血再灌注大鼠一氧化氮系统和ICAM－1mRNA表达的影响［J］.陕西医学杂志，2006，35（12）：1582－1585.

［8］Wink DA，Hanbauer I，Krishna MC.Nitric oxide protects against cellular damage and cytotoxicity from reactive oxygen species［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1993，90（21）：9813－9817.

［9］Rufanova VA，Pozdnev VF，Kalenikova E，et al.Endothelin－camverting entyme inhibition in the rat model of acute heart failure：function and neurohormonal action［J］.Exp Biol Med，2009，234（10）：1201－1211.

［10］宋晓晶，张栋，马慧敏，等.电针对小鼠肝组织内ET－1、NO含量的影响［J］.中华中医药杂志，2011，26（9）：1978－1981.

［11］Liu X，Qiu J，Zhao S，et al.Grape seed proanthocyanidin extract alleviates ouabain－induced vascular remodeling through regulation of endothelial function［J］.Mol Med Report，2012，6（5）：948－954.

［12］汤春光，王利宏，俞桂芬，等.IL218、NO、ET对评价冠脉粥样硬化狭窄程度的临床价值［J］.放射免疫学杂志，2010，23（4）：373－375.