微流体芯片(lab-on-chip)技术检测食源性致病菌的应用研究

陈炯+屠丽红+陈艳新+秦胜营

[摘要]

目的：通过应用微流体芯片（lab-on-chip）技术检测食源性致病菌，包括霍乱弧菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌等细菌的灵敏度和精确度，从而建立突发公共卫生事件现场实验室的解决方案。方法：分别采用Lab-on-chip平台食源性病原体微流检测芯片和荧光PCR方法对食源性病原菌样本进行检测，对比分析食源性微流芯片检测方法的特异性、敏感度、准确性和重复性等。根据Lab-on-chip说明书以及荧光定量PCP试剂盒操作说明进行操作。结果：Lab-on-chip方法的霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌检出限为：5x103 to 103 DNA Copies/ml。特异性、准确性和重复性都获得了良好的结果。 结论：Lab-on-chip方法具有快速、便捷、高效、准确等优点，可以在突发公共卫生事件中作为良好的检测工具和方法。

[关键词] Lab-on-chip微流体芯片；食源性致病菌；检测方法

* “十二五”重大传染病防治国家重大科技专项：致病菌新型分子血清型分型系统的建立（No. 2013ZX10004216-001-004）

[作者简介] 陈炯（1978- ），男，主管技师，医学学士，主要从事微生物检验研究工作。单位：上海市疾病预防控制中心（地址：上海市长宁区中山西路1380号，邮编200336）联系电话：13817529058，邮箱：jchen_4@scdc.sh.cn

[通讯作者] 陈敏 mchen@scdc.sh.cn 联系电话：13671927931

Lab-on-chip for the detection of food borne pathogenic bacteria

Chen Jiong1 , Tu Lihong1, Chen Yanxin1, Qin Shengying2

(1. Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 200336, China;

2. The Bio-X Institutes of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200336, China)

Author for correspondence: Chen Min

[Abstract]Objective：To set up an onsite protocol for abrupt emergencies of public health, both the sensitivity and accuracy of the lab-on-chip forthe detection of food borne pathogenic bacterium including Vibrio cholera, Salmonella, Vibrio parahaemolyticus and Shigellaare exanimated. Methods: Comparing the results from the chips and fluorescence quantitative PCR, the specificity, sensitivity, accuracy and repeatability of the Lab-on-chip are analyzed. Result: Acceptable specificity, accuracy and repeatability of the chips are achieved, the limitation of the chips for the Vibrio cholera, Salmonella, Vibrio parahaemolyticus and Shigella is 5x103 to 103 DNA Copies/ml. Conclusion: Lab-on-chip is considered as a fast, convenient, efficient tool with acceptable accuracy for public health emergencies.

[Key words] Lab-on-chip, Food borne pathogen, detection method

食源性致病菌引起的感染性腹泻是世界范围内发病率和死亡率仅次于心血管疾病的第二大疾病。由于全球性食品贸易的快速增长，目前微生物污染所引起的食源性疾病作为一个严重的公共卫生问题已引起人们的广泛关注和深入研究，食源性疾病对人类健康构成了巨大的威胁，食品安全已成为世界性公共卫生问题[1]。无论在发达国家或发展中国家食源性细菌污染都是影响食品安全的最主要原因。近几年来全球许多国家多次爆发由上述致病菌所致的食源性疾病。特别是2012年在欧洲发生的毒黄瓜事件受到了全球的广泛关注。以20世纪90年代后我国法定报告传染病的发病数来看，由于食源性致病菌导致的疾病发病率一直名列前茅[2]。霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、痢疾杆菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、弯曲杆菌、产气荚膜梭菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌和出血性大肠杆菌O157等十八种病原体是引起食源性感染的重要病原体，常常在特定范围内引起大规模暴发流行。

如何快速、准确地检测并确定病原体是实验室能力建设和技术保障的核心内容。长期以来，在食源性致病细菌检测方面以培养方法为主，目前也有PCR相关方法进行检测，但培养方法不仅操作繁琐、耗时，而且容易漏检[3]。对于PCR方法而言，其检测通量有限，对实验室的分区要求高。同时这些方法的检测周期长，如细菌的检测方法中传统的培养方法（GB法）、SN方法，以抗体为基础的免疫检测方法等一般都需要6个小时以上的检测时间[4]。作为应对公共卫生突发事件的疾病预防机构在疫情处置方面有其特殊性，不仅要求对病原体“检得出”，还要求能够“检得准、检得快”，要拥有“一锤定音”的能力才满足现场快速处置疫情的需要。

笔者旨在通过研究Lab-on-chip快速检测方法对重要食源性病原体及危害因子的检测应用。此项研究采用的四个菌种全面考虑了这些菌株在疾病预防控制工作中的特殊地位。霍乱弧菌属于甲类传染病，是突发集团腹泻等公共卫生事件中必检的工作；志贺氏菌为乙类传染病中最受关注的一种；沙门氏菌和副溶血性弧菌都属于丙类传染病，其中沙门氏菌(非伤寒类)为国际疾病预防机构最为关注的传染性致病菌，而副溶血性弧菌是包括上海在内的沿海城市中最为常见的腹泻致病菌。Lab-on-chip方法不仅能够拓展病原体检测的方法学研究，加强对食品安全的管理，而且大大缩短了检测时间，为现场处置及时提供准确依据，并可以实现对国内外法律法规重点管控的食品进行食源性致病菌现场快速检测与鉴定，填补了相关检测空白。

1 材料

1.1试验菌株

霍乱弧菌（n=30）、沙门氏菌（n=36）、志贺氏菌（n=34）、副溶血性弧菌（n=31），空肠弯曲菌（n=8）、金黄色葡萄球菌（n=7）、大肠杆菌EHEC（n=7）、单核细胞李斯特菌（n=8）以上菌种均来源于上海市疾病预防控制中心实验室保藏。

1.2 模拟样品

模拟样品采用奶粉中加入包括霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌在内的多种菌株，同时加入其它食源性致病菌（包括空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌EHEC、单核细胞李斯特菌）用于准确性和特异性检测（所有菌株均稀释至104 DNA Copies/ml）。

1.3 实际样品

对于从市场中购买的32份鱼类海产品进行副溶血性弧菌的检测。

1.4 试剂盒

Lab-on-chip：细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN，QIAprep Spin Miniprep Kit)；芯片杂交液和洗脱液(上海佰真生物有限公司)；探针和引物由新加坡威特实验室合成。

荧光PCR：核酸抽提液、核酸荧光PCR检测混合液、Taq + UNG酶由上海之江生物科技股份有限公司提供。

1.5仪器及耗材

生物芯片 (上海佰真生物有限公司)；温度控制PCR扩增-杂交系统(上海佰真生物有限公司)；芯片阅读仪(上海佰真生物有限公司)；实时荧光PCR仪（Bio rad CFX96）。

2方法

2.1 引物及探针的设计与合成

以在细菌分类鉴定学上具有重要意义的特异性基因片段作为芯片检测的靶基因，霍乱弧菌和副溶血性弧菌采用Tu基因，沙门氏菌采用Muts毒力基因，志贺氏菌采用Reg-O-Ag基因。为了使探针分子在芯片上伸展开来，利于靶标探针的杂交，合成时在每个探针的5加上1个氨基和15个T。引物和探针由新加坡威特实验室合成，正链引物用TAMRA荧光标记。

2.2芯片的制备

采用醛基修饰的基片，利用合成好的探针点制到芯片上，氨基修饰的寡聚核苷酸探针和芯片表面的醛基相连从而固定到芯片上。在点样时同时设置芯片固定阳性对照、试验阳性及阴性对照。（见图1）

图1 Lab on chip芯片点阵分布图

2.3 DNA抽提

利用QIAGEN试剂盒，对检测样品进行DNA抽提。

2.4 Lab-on-chip检测

PCR反应：稀释PCR control；混合PCR 反应液(A,B两管)，12.5ul/管；将反应液加入芯片，每个加样孔11.5ul；将芯片放入反应室内进行反应；杂交反应：杂交反应液的配制，将870ul杂交缓冲液与30ul杂交探针混合均匀；将杂交反应液加入芯片，每个加样孔14.5ul，将芯片放入反应室内进行反应；清洗：洗液，3000r/m 离心2min两次；结果测定：扫描芯片上的条码，将芯片插入芯片阅读仪中进行结果判读。

2.5荧光PCR检测[5]

试剂配制加样：36ul样品核酸荧光PCR检测混合液，4ul（Taq酶+UNG）模板；PCR扩增：37℃×2min、94℃×2min；再按93℃×15sec - 60℃×60sec，循环40次；单点荧光检测在60℃。反应体系为40ul。

2.6 方法的特异性、准确性、检出限和重复性检测

2.6.1 特异性检测

选取四种目标菌分离株各30株和其他不同菌株之间进行特异性检测。按照优化好的条件进行多重PCR扩增，然后将PCR产物与芯片杂交。

2.6.2 准确性检测

同时进行荧光PCR检测，比较方法的准确性。每组试验重复3次。

2.6.3 检出限测定

取四种目标菌的24h增菌培养物，制成DNA模板后，分别以10倍梯度稀释至103-102 DNA Copies/ml，首先按照优化好的条件进行多重PCR扩增，然后将PCR产物与芯片杂交。以3次试验均检出细菌的浓度作为灵敏度。

2.6.4 重复性检测

对同一种目标菌株进行重复3次的试验，比较其重复性。

2.7 模拟样品检测一致性比对

用Lab-on-chip方法和荧光PCR的方法同时对加入包括霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌在内的多种菌株，并加入包括空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌EHEC、单核细胞李斯特菌等其它食源性致病菌的奶粉样品进行检测（所有菌株均稀释至104 DNA Copies/ml）。

2.8 实际样品检测

同时用Lab-on-chip方法和荧光PCR的方法对于从市场中购买的32份鱼类海产品进行副溶血性弧菌的检测。

3 结果

3.1 芯片检测结果图示见图2：

图2 芯片检测结果图例

3.2 芯片特异性结果：

选取霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌分离株各30株、空肠弯曲菌8株、金黄色葡萄球菌7株、大肠杆菌EHEC7株、单核细胞李斯特菌8株，进行单盲设计后检测，霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌的特异性分别达到100%、100%、96.7%、100%。（见表1-4）表明制备的芯片对目标菌具有较好的特异性。

表1Lab-on-chip方法检测霍乱弧菌结果准确性和特异性

霍乱弧菌 Lab-on-chip方法 准确性（%） 特异性（%）

检出阳性 检出阴性 合计

阳性 30 0 30 100 -

阴性 0 30 30 - 100

合计 30 30 60

表2Lab-on-chip方法检测沙门氏菌结果准确性和特异性

沙门氏菌 Lab-on-chip方法 准确性（%） 特异性（%）

检出阳性 检出阴性 合计

阳性 29 1 30 96.7 -

阴性 0 30 30 - 100

合计 29 31 60

表3Lab-on-chip方法检测志贺氏菌结果准确性和特异性

志贺氏菌 Lab-on-chip方法 准确性（%） 特异性（%）

检出阳性 检出阴性 合计

阳性 28 2 30 93.3 -

阴性 1 29 30 - 96.7

合计 29 31 60

表4Lab-on-chip方法检测副溶血性弧菌结果准确性和特异性

副溶血性弧菌 Lab-on-chip方法 准确性（%） 特异性（%）

检出阳性 检出阴性 合计

阳性 29 1 30 96.7 -

阴性 0 30 30 - 100

合计 29 31 60

3.3 芯片准确性评价

霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌的准确性分别达到100%、96.7%、93.3%、96.7%。（见表1-4）

3.4 芯片检出限测定结果：

lab-on-chip方法对霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌的检测检出限为 5x103 to 103 DNA Copies/ml，较荧光PCR方法的检测检出限为103 DNA Copies/ml。两种方法的灵敏度相当[6]。

3.5芯片重复性检测结果：

对每个菌株进行的3次重复检测试验，结果均一致。

3.6模拟样品检测方法一致性比对：

选取48个加标食源性病原菌模拟样本进行荧光PCR和Lab - on - chip平台进行检测的结果分析和统计见表5-8。

表5Lab-on-chip方法与荧光PCR法检测霍乱弧菌结果一致性分析

荧光PCR法 一致率(%)

阳性 阴性 合计 阳性 阴性

Lab-on-chip方法 阳性 30 0 30 100 -

阴性 1 17 18 - 94

合计 31 17 48 97.9

表6Lab-on-chip方法与荧光PCR法检测沙门氏菌结果一致性分析

荧光PCR法 一致率(%)

阳性 阴性 合计 阳性 阴性

Lab-on-chip方法 阳性 35 1 36 97 -

阴性 0 12 12 - 100

合计 35 13 48 97.9

表7Lab-on-chip方法与荧光PCR法检测志贺氏菌结果一致性分析

荧光PCR法 一致率(%)

阳性 阴性 合计 阳性 阴性

Lab-on-chip方法 阳性 33 1 34 97 -

阴性 1 13 14 - 93

合计 34 14 48 95.8

表8Lab-on-chip方法与荧光PCR法检测副溶血性弧菌结果一致性分析

荧光PCR法 一致率(%)

阳性 阴性 合计 阳性 阴性

Lab-on-chip方法 阳性 31 0 31 100 -

阴性 1 16 17 - 94

合计 32 16 48 97.9

3.7 Lab-on-chip平台在实际样品中检测副溶血性弧菌的结果

使用Lab-on-chip平台和荧光PCR的方法对实际样品（鱼类海产品）中的副溶血性弧菌进行检测。检出率情况见表9，检测结果一致性情况见表10。

表9副溶血性弧菌检出率

项目 检测数 荧光PCR法 Lab-on-chip方法

检出数 检出率% 检出数 检出率%

海产品 32 6 18.7 5 15.6

表10实际样品副溶血性弧菌检测结果一致性分析

荧光PCR法 一致率(%)

阳性 阴性 合计 阳性 阴性

Lab-on-chip方法 阳性 5 0 5 100 -

阴性 1 26 27 - 96.3

合计 6 26 32 96.9

4 讨论

Lab-on-chip平台是20世纪末发展起来的一种微流体芯片诊断分析技术。Lab-on-chip方法是按照预定位置固定在固相载体上的大量核酸分子所组成的微阵列，在一定条件下载体上的核酸分子与样品的序列互补的核酸片段杂交，同时对样品中的核酸片段标记，在专用的芯片阅读仪上进行检测。该方法具有准确、快速、便捷、高效、信息量大，无需分离培养，不依赖于PCR实验室平台等特点，因而发展迅速。近年来，生物芯片在食品检测中的应用，包括对转基因食品、食品微生物、食品营养成分、食品原料等领域检测应用越来越广泛 [7]。

此项研究的试验结果表明，这种方法设计的探针和引物具有良好的特异性。Lab-on-chip方法与传统检测方法相比只需要对样品进行初增菌，无需分离培养，通过PCR扩增、杂交试验，最快2h内即可获得检测结果，从检测时限方面大大缩短了现场检验的检测周期。

该研究建立了检测食品中常见四种致病微生物的Lab-on-chip方法，该方法与疾病预防系统目前使用的荧光PCR的检验标准方法结果有很好的一致性，芯片重复性检测结果试验显示芯片的重复性良好，稳定性较强；lab-on-chip方法的检测灵敏度达到5x103 to 103 DNA Copies/ml与荧光PCR方法的检测灵敏度103 DNA Copies/ml 相当，达到了应急检测实验室的检测要求，其精确度、准确性、重复性与经典的荧光PCR相当，因此lab-on-chip方法检测结果可靠。同时具有快速、便捷、高效、准确等优点。

从实验条件来看，Lab-on-chip方法无需依赖PCR实验室分区平台，具备了实验场所可移动的优点，可以作为突发公共卫生应急事件现场实验室，能在突发公共卫生应急事件中大大提高检测效率和准确性，有利于疾病预防机构在突发公共卫生事件中作为良好的现场检测工具和方法。

从实验结果显示Lab-on-chip方法对于霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌四种食源性致病菌的特异性分别达到100%、100%、96.7%、100%表明该方法对于四种菌的特异性良好，其中志贺氏菌的特异性较低些，源于在特异性实验中使用的大肠杆菌EHEC与志贺氏菌有一定的类似基因片段所致。今后可以在芯片引物设计上进一步加以优化，从而使其特异性进一步提高。另一方面，在使用目前的芯片检出志贺氏菌的同时提示有大肠杆菌EHEC存在的可能性。

由于研究时间和实际条件的限制，在实际样品的检测中只选择了海产品中的副溶血性弧菌，对于lab-on-chip方法在其他菌种实际样品中的检出率情况还有待进一步的研究。

(致谢：本项研究得到了上海交通大学门Bio-X研究院和新加坡威特实验室的支持与帮助，同时得到了本中心微生物检测实验室张曦主任的支持与帮助，微生物检测实验室的庄源等同志也参加了检测工作，在此一并致谢!)

[参考文献]

[1] Jeong-Yeol Yoon. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety[J]. Sensors 2012, 12, 10713-10741

[2] 蔡炯. 食源性疾病的现状与防治(综述)[J]. 中国卫生检验杂志，2011,15(9): 1150-1152．

[3] Yixian Wang. New Trends in Impedimetric Biosensors for the Detection of Food borne Pathogenic Bacteria [J].Sensors 2012, 12, 3449-3471

[4] GB4789-2010食品卫生检验方法微生物学部分[S]．

[5] 杨俊超. 实时荧光定量PCR法与常规PCR法及细菌培养法检测沙门菌的比较[J]. 浙江预防医学2009，21（11）92-93

[6] 曾华. 实时荧光定量PCR法与基因芯片法检测HPV的比较[J]. 分子诊断与治疗杂志 2013,5（3）165-169

[7] 肖进文. 猪肉及其制品中几种病原微生物芯片检测方法的建立及应用[J]. 安徽农业科学2010，38(18)：9478-9480，9607

阴性 0 12 12 - 100

合计 35 13 48 97.9

表7Lab-on-chip方法与荧光PCR法检测志贺氏菌结果一致性分析

荧光PCR法 一致率(%)

阳性 阴性 合计 阳性 阴性

Lab-on-chip方法 阳性 33 1 34 97 -

阴性 1 13 14 - 93

合计 34 14 48 95.8

表8Lab-on-chip方法与荧光PCR法检测副溶血性弧菌结果一致性分析

荧光PCR法 一致率(%)

阳性 阴性 合计 阳性 阴性

Lab-on-chip方法 阳性 31 0 31 100 -

阴性 1 16 17 - 94

合计 32 16 48 97.9

3.7 Lab-on-chip平台在实际样品中检测副溶血性弧菌的结果

使用Lab-on-chip平台和荧光PCR的方法对实际样品（鱼类海产品）中的副溶血性弧菌进行检测。检出率情况见表9，检测结果一致性情况见表10。

表9副溶血性弧菌检出率

项目 检测数 荧光PCR法 Lab-on-chip方法

检出数 检出率% 检出数 检出率%

海产品 32 6 18.7 5 15.6

表10实际样品副溶血性弧菌检测结果一致性分析

荧光PCR法 一致率(%)

阳性 阴性 合计 阳性 阴性

Lab-on-chip方法 阳性 5 0 5 100 -

阴性 1 26 27 - 96.3

合计 6 26 32 96.9

4 讨论

Lab-on-chip平台是20世纪末发展起来的一种微流体芯片诊断分析技术。Lab-on-chip方法是按照预定位置固定在固相载体上的大量核酸分子所组成的微阵列，在一定条件下载体上的核酸分子与样品的序列互补的核酸片段杂交，同时对样品中的核酸片段标记，在专用的芯片阅读仪上进行检测。该方法具有准确、快速、便捷、高效、信息量大，无需分离培养，不依赖于PCR实验室平台等特点，因而发展迅速。近年来，生物芯片在食品检测中的应用，包括对转基因食品、食品微生物、食品营养成分、食品原料等领域检测应用越来越广泛 [7]。

此项研究的试验结果表明，这种方法设计的探针和引物具有良好的特异性。Lab-on-chip方法与传统检测方法相比只需要对样品进行初增菌，无需分离培养，通过PCR扩增、杂交试验，最快2h内即可获得检测结果，从检测时限方面大大缩短了现场检验的检测周期。

该研究建立了检测食品中常见四种致病微生物的Lab-on-chip方法，该方法与疾病预防系统目前使用的荧光PCR的检验标准方法结果有很好的一致性，芯片重复性检测结果试验显示芯片的重复性良好，稳定性较强；lab-on-chip方法的检测灵敏度达到5x103 to 103 DNA Copies/ml与荧光PCR方法的检测灵敏度103 DNA Copies/ml 相当，达到了应急检测实验室的检测要求，其精确度、准确性、重复性与经典的荧光PCR相当，因此lab-on-chip方法检测结果可靠。同时具有快速、便捷、高效、准确等优点。

从实验条件来看，Lab-on-chip方法无需依赖PCR实验室分区平台，具备了实验场所可移动的优点，可以作为突发公共卫生应急事件现场实验室，能在突发公共卫生应急事件中大大提高检测效率和准确性，有利于疾病预防机构在突发公共卫生事件中作为良好的现场检测工具和方法。

从实验结果显示Lab-on-chip方法对于霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌四种食源性致病菌的特异性分别达到100%、100%、96.7%、100%表明该方法对于四种菌的特异性良好，其中志贺氏菌的特异性较低些，源于在特异性实验中使用的大肠杆菌EHEC与志贺氏菌有一定的类似基因片段所致。今后可以在芯片引物设计上进一步加以优化，从而使其特异性进一步提高。另一方面，在使用目前的芯片检出志贺氏菌的同时提示有大肠杆菌EHEC存在的可能性。

由于研究时间和实际条件的限制，在实际样品的检测中只选择了海产品中的副溶血性弧菌，对于lab-on-chip方法在其他菌种实际样品中的检出率情况还有待进一步的研究。

(致谢：本项研究得到了上海交通大学门Bio-X研究院和新加坡威特实验室的支持与帮助，同时得到了本中心微生物检测实验室张曦主任的支持与帮助，微生物检测实验室的庄源等同志也参加了检测工作，在此一并致谢!)

[参考文献]

[1] Jeong-Yeol Yoon. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety[J]. Sensors 2012, 12, 10713-10741

[2] 蔡炯. 食源性疾病的现状与防治(综述)[J]. 中国卫生检验杂志，2011,15(9): 1150-1152．

[3] Yixian Wang. New Trends in Impedimetric Biosensors for the Detection of Food borne Pathogenic Bacteria [J].Sensors 2012, 12, 3449-3471

[4] GB4789-2010食品卫生检验方法微生物学部分[S]．

[5] 杨俊超. 实时荧光定量PCR法与常规PCR法及细菌培养法检测沙门菌的比较[J]. 浙江预防医学2009，21（11）92-93

[6] 曾华. 实时荧光定量PCR法与基因芯片法检测HPV的比较[J]. 分子诊断与治疗杂志 2013,5（3）165-169

[7] 肖进文. 猪肉及其制品中几种病原微生物芯片检测方法的建立及应用[J]. 安徽农业科学2010，38(18)：9478-9480，9607

阴性 0 12 12 - 100

合计 35 13 48 97.9

表7Lab-on-chip方法与荧光PCR法检测志贺氏菌结果一致性分析

荧光PCR法 一致率(%)

阳性 阴性 合计 阳性 阴性

Lab-on-chip方法 阳性 33 1 34 97 -

阴性 1 13 14 - 93

合计 34 14 48 95.8

表8Lab-on-chip方法与荧光PCR法检测副溶血性弧菌结果一致性分析

荧光PCR法 一致率(%)

阳性 阴性 合计 阳性 阴性

Lab-on-chip方法 阳性 31 0 31 100 -

阴性 1 16 17 - 94

合计 32 16 48 97.9

3.7 Lab-on-chip平台在实际样品中检测副溶血性弧菌的结果

使用Lab-on-chip平台和荧光PCR的方法对实际样品（鱼类海产品）中的副溶血性弧菌进行检测。检出率情况见表9，检测结果一致性情况见表10。

表9副溶血性弧菌检出率

项目 检测数 荧光PCR法 Lab-on-chip方法

检出数 检出率% 检出数 检出率%

海产品 32 6 18.7 5 15.6

表10实际样品副溶血性弧菌检测结果一致性分析

荧光PCR法 一致率(%)

阳性 阴性 合计 阳性 阴性

Lab-on-chip方法 阳性 5 0 5 100 -

阴性 1 26 27 - 96.3

合计 6 26 32 96.9

4 讨论

Lab-on-chip平台是20世纪末发展起来的一种微流体芯片诊断分析技术。Lab-on-chip方法是按照预定位置固定在固相载体上的大量核酸分子所组成的微阵列，在一定条件下载体上的核酸分子与样品的序列互补的核酸片段杂交，同时对样品中的核酸片段标记，在专用的芯片阅读仪上进行检测。该方法具有准确、快速、便捷、高效、信息量大，无需分离培养，不依赖于PCR实验室平台等特点，因而发展迅速。近年来，生物芯片在食品检测中的应用，包括对转基因食品、食品微生物、食品营养成分、食品原料等领域检测应用越来越广泛 [7]。

此项研究的试验结果表明，这种方法设计的探针和引物具有良好的特异性。Lab-on-chip方法与传统检测方法相比只需要对样品进行初增菌，无需分离培养，通过PCR扩增、杂交试验，最快2h内即可获得检测结果，从检测时限方面大大缩短了现场检验的检测周期。

该研究建立了检测食品中常见四种致病微生物的Lab-on-chip方法，该方法与疾病预防系统目前使用的荧光PCR的检验标准方法结果有很好的一致性，芯片重复性检测结果试验显示芯片的重复性良好，稳定性较强；lab-on-chip方法的检测灵敏度达到5x103 to 103 DNA Copies/ml与荧光PCR方法的检测灵敏度103 DNA Copies/ml 相当，达到了应急检测实验室的检测要求，其精确度、准确性、重复性与经典的荧光PCR相当，因此lab-on-chip方法检测结果可靠。同时具有快速、便捷、高效、准确等优点。

从实验条件来看，Lab-on-chip方法无需依赖PCR实验室分区平台，具备了实验场所可移动的优点，可以作为突发公共卫生应急事件现场实验室，能在突发公共卫生应急事件中大大提高检测效率和准确性，有利于疾病预防机构在突发公共卫生事件中作为良好的现场检测工具和方法。

从实验结果显示Lab-on-chip方法对于霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌四种食源性致病菌的特异性分别达到100%、100%、96.7%、100%表明该方法对于四种菌的特异性良好，其中志贺氏菌的特异性较低些，源于在特异性实验中使用的大肠杆菌EHEC与志贺氏菌有一定的类似基因片段所致。今后可以在芯片引物设计上进一步加以优化，从而使其特异性进一步提高。另一方面，在使用目前的芯片检出志贺氏菌的同时提示有大肠杆菌EHEC存在的可能性。

由于研究时间和实际条件的限制，在实际样品的检测中只选择了海产品中的副溶血性弧菌，对于lab-on-chip方法在其他菌种实际样品中的检出率情况还有待进一步的研究。

(致谢：本项研究得到了上海交通大学门Bio-X研究院和新加坡威特实验室的支持与帮助，同时得到了本中心微生物检测实验室张曦主任的支持与帮助，微生物检测实验室的庄源等同志也参加了检测工作，在此一并致谢!)

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