平板倾注法与薄膜过滤法测定生物负载的比较

徐琳 邹婷

摘 要：目的 用薄膜过滤法和平板倾注法对无酒精口腔洗剂一类的医疗用品进行初始污染菌检测，选择适合此类产品的检测方法。方法 采用ISO 11737-1： 2006医疗器械的灭菌-微生物方法-第一部分：产品上微生物总数的估计，对供试品进行初始污染菌检测试验。结果 用薄膜过滤法对无酒精口腔洗剂进行检测，总平均菌落数是8cfu/件；用平板倾注法对无酒精口腔洗剂进行检测，总平均菌落数是1800cfu/件。结论 对无酒精口腔洗剂此类产品检测时，宜采用薄膜过滤法。

关键词：薄膜过滤法；平板倾注法

随着近几年来经济发展迅猛，科技进步加快，人们的生活水平提高，对医疗卫生用品的需求也越来越多，企业也根据人们的需求生产出了一系列产品。这就需要检验人员根据不同的产品制定合适的检测方案。本文就无酒精口腔洗剂，采用薄膜过滤法和平板倾注法对其初始污染菌检测进行探讨。

一、材料与试剂

（一）试验材料。试验样品为某公司生产的无酒精口腔洗剂，400ml/瓶，绿色。

（二）试验菌种。大肠埃希菌〔CMCC（B）44102〕第三代；金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕第三代；枯草芽孢杆菌〔CMCC

（B）63 501〕第三代；白色念珠菌〔CMCC（F）98 001〕第三代；黑曲霉〔CMCC（F） 98 003〕第四代；均购买自中科院微生物研究所。

（三）试剂。0.9%NaCl溶液（国药集团化学试剂有限公司）；大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）（中国腹泻病控制上海试剂供应研究中心）；虎红培养基（RBA）（北京奥博星生物技术有限责任公司）；大豆酪蛋白消化物肉汤培养基（SCDB）（中国腹泻病控制上海试剂供应研究中心）。

（四）仪器。高压灭菌器；生化培养箱；超净工作台；生物安全柜。

二、试验方法

（一）平板倾注法方法验证。（1）菌悬液制备 用0.9%无菌氯化钠溶液将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物制备成50-100 cfu/ml的菌悬液备用，用含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将黑曲霉的新鲜培养物制备成50-100 cfu/ml的孢子悬液备用。（2）试验组 取样品原液2 ml，分别接种于2个平板，每平板1 ml，同时每平板加入1 ml菌悬液，每平板注入15-20 ml培养基后培养；（3）菌液组 取菌悬液2 ml，分别接种于2个平板，每平板1 m，每平板注入15-20 ml培养基后培养。（4）样品对照组 取样品原液2 ml，分别接种于2个平板，每平板1 m，每平板注入15-20

ml培养基后培养。（5）进行三次独立的平行试验。（6）平均回收率。平均回收率（%）=×100%。（7）判断标准平均回收率≥70%。（8）结果。（9）结论 平均回收率≥70%，可以在此条件下进行细菌、霉菌计数。

（二）平板倾注法。（1）洗脱液 0.9%NaCl溶液。（2）样品处理 以无菌操作转移试验样品（SIP=1ml）至10ml洗脱液中，于旋涡混合器（2800转/分钟）中振荡2min备用。（3）细菌培养 产品洗脱液2ml，分别接种于2个平板，每平板1ml。每平板注入20ml TSA，30-35℃培养3-7天。（4）霉菌培养 产品洗脱液

2ml，分别接种于2个平板， 每平板1ml。每平板注入20ml RBA，20-25℃培养5-7天。（5）计数 按菌落计数原则进行计数，再乘以稀释倍数，计算出每件产品的菌落数（cfu/件）。

（三）薄膜过滤法方法验证。（1）菌悬液制备 用0.9%无菌氯化钠溶液将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物制备成50-100 cfu/ml的菌悬液备用，用含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将黑曲霉的新鲜培养物制备成50-100 cfu/ml的孢子悬液备用。（2）试验组 取无酒精口腔洗剂100ml，同时加入1 ml菌悬液，过滤后，将膜放在琼脂平皿上，30-35℃培养3-7天。（3）菌液组 取菌悬液2 ml，分别接种于2个平板，每平板1 m，每平板注入15-20

ml培养基后培养。（4）样品对照组 过滤100ml的无酒精口腔洗剂，将膜放在琼脂平皿上，30-35℃培养3-7天。（5）进行三次独立的平行试验。

三、结果

表1 薄膜过滤法检测结果

表2 平板倾注法检测结果

四、讨论

由以上两表得知，用薄膜过滤法对无酒精口腔洗剂进行检测，总平均菌落数是8cfu/件；用平板倾注法对无酒精口腔洗剂进行检测，总平均菌落数是1800cfu/件。如果以此结果来作为生产过程的常规控制，或以此来为了确立灭菌过程的处理程度，两者结果相比，平板倾注法会产生较大的误差，会给企业的分析带来误导，会给后续的判断带来一系列的误差。

平板倾注法是直接吸取洗脱液，倾注培养基进行培养，试验简单易操作，但对于含菌数少的产品来说，用此类的方法进行试验，容易漏检。洗脱时产品上残留的微生物越多，对后续产品灭菌后残留微生物的概率就相对比较大，因此，这样方法对微生物集中水平较低的洗脱液的敏感度较差。

薄膜过滤法是将适当孔径的滤膜放入过滤器，过滤样品洗脱液，由于滤膜的作用将微生物保留在膜的表面上。然后，将滤膜放在培养基上培养。采用膜过滤法进行微生物检测是一种国际公认的微生物标准检验方法，广泛应用于环境检测、化妆品、制药工业品质控制等领域。与平板倾注法比，浓缩效应使微生物检测的准确度提高，不仅对于液体制剂这样的产品适用，对于大件无法切割的产品也同样被采纳。

参考文献：

[1] Sterilization of Medical Devices-Microbiological Method-Part 1：Determination of a Population of Microorganisms on Products， ISO11737-1：2006.

[2] 中国药典2010第二部附录XI J微生物限度检查法.