梅州金柚果肉中过氧化物酶特性的研究

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(华南理工大学轻工与食品学院,广东广州 510640)

梅州金柚果肉中过氧化物酶特性的研究

黎婕,陈中*,林伟锋

(华南理工大学轻工与食品学院,广东广州 510640)

以愈创木酚为底物,对金柚果肉过氧化物酶(POD)的特性进行研究。结果表明,POD的最适提取pH为6.4,最适反应温度范围为30～80℃,在范围为5.0～8.0的pH环境下POD的活性变化不大,选择6.8作为其最适反应pH。在本实验条件(pH6.8,30℃)下,Vmax=25.64U/min,Km=8.74mmol/L,高于80℃处理,POD开始被钝化。

梅州金柚,过氧化物酶,酶学特性

柚类是柑橘家族中和的后起之秀,它果形硕大、果肉晶莹、风味独特,其维生素C的含量比甜橙、橘类高2～4倍、耐贮藏运输,号称天然罐头[1]。柚子成熟后富含糖类抗坏血酸和一些酶类,整体存放的柚子可以维持较长时间。但是在加工过程和存放过程中,颜色会逐渐变深,严重影响感观质量和产品的商品价值。褐变是柚子加工过程中最容易发生的现象,褐变一般有两种：一种是非酶褐变；另一种是酶促褐变,柚子中的单宁等物质在多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,PPO)和过氧化物酶(Peroxidase,POD)作用下生成褐色产物[2]。作者已对梅州金柚中多酚氧化酶的特性进行过系统研究[3],故本实验以梅州金柚中的过氧化物酶作为研究对象。果蔬中的POD通常与新鲜产品或加工产品(包括冷冻产品)的风味和品质有关,食品加工研究人员已将其活性列为果蔬加工的主要指标[4]。目前,关于植物体内过氧化物酶的研究多数集中于它的理化过程,对金柚过氧化物酶的酶学特性研究报道很少。金柚果实脆嫩化渣、味甜少酸、营养丰富,深受消费者欢迎[5]。梅州金柚已有百年栽培历史。目前,梅州市金柚种植总面积40万亩,年产量在50万吨以上,是全世界最大的金柚商品生产基地,是享誉盛名的“中国金柚之乡”[6]。本实验较为系统地对梅州金柚果肉中过氧化物酶的酶学特性进行研究,为进一步利用这一优良资源,科学控制深加工过程中的酶促褐变提供依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

梅州金柚 市售；丙酮、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸、巴比妥钠、盐酸、愈创木酚、30%过氧化氢 分析纯。

JM-L50胶体磨 温州市龙湾永兴张祥胶体磨厂；JJ-2B 高速组织捣碎机 常州市伟嘉仪器制造有限公司；UV6100A紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；5418小型高速离心机 德国eppendorf有限公司；TC10K电子天平 美国双杰兄弟(集团)有限公司；B11-2转速数显恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司。

1.2粗酶液的制备

[7]，将柚子去皮、去囊,将一定量柚子肉在胶体磨中打成浆状,量取100mL肉浆,加入200mL丙酮(-20℃),高速组织捣碎机以8000r/min匀浆2min,用布氏漏斗抽滤,滤饼用200mL丙酮(-20℃)再次抽滤,将滤饼置于蒸发皿中,用冷风将残留的丙酮吹干,约得白色粉末12g,即为过氧化物酶丙酮抽提粉,以下简称为丙酮粉,将丙酮粉置于-20℃下存放。取丙酮粉1.0g,加入100mL预冷(4℃)磷酸缓冲溶液(0.05mol/L,pH6.4),磁力搅拌30min,5000r/min离心20min,上清液过滤即得POD粗酶液。

1.3 POD酶活力的测定

参比液为磷酸缓冲溶液2.25mL(0.05mol/L,pH6.4)、2%愈创木酚溶液0.75mL、2%过氧化氢溶液0.75mL,摇匀后在水浴中预热10min；待测液为磷酸缓冲溶液1.5mL(0.05mol/L,pH6.4)、愈创木酚溶液0.75mL、2%过氧化氢溶液0.75mL,摇匀在水浴中预热10min,测定前再加入预热的POD粗酶液0.75mL,马上在470nm波长下进行比色测定,酶液加入后开始计时,每1s记录一次吸光值OD值,共记录5min,对照不加酶液的参比液,酶活力以1minOD值每增0.01为一个活力单位。

1.4 POD最适提取pH的测定

在制备POD粗酶液时,将丙酮粉置于pH分别为5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4磷酸缓冲溶液(0.05mol/L)中,制备成不同pH的POD粗酶液,测定时选用pH6.4的磷酸缓冲溶液(0.05mol/L)、2%愈创木酚溶液,在30℃下按照1.3中的方法测定不同pH粗酶液的POD酶活力的变化。以最高酶活力为100%,计算POD相对酶活。

1.5 POD最适反应pH的测定

配制pH为3、4、5、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、8、9、9.6的一系列缓冲溶液,测定时选用pH6.8提取的POD粗酶液、2%愈创木酚溶液,在30℃下按照1.3中的方法测定不同pH缓冲溶液的POD酶活力的变化。按照1.3中方法测定不同pH下POD活性的变化。以最高酶活力为100%,计算POD相对酶活。

1.6 POD最适反应温度的测定

取pH6.4磷酸缓冲溶液(0.05mol/L),20mL 2%愈创木酚溶液10mL、2%过氧化氢溶液10mL和pH6.8下提取的POD粗酶液5mL分别在30、40、50、60、70、80、90℃的水浴中保温10min,按照1.3中的方法测定不同温度下POD活性的变化。以最高酶活力为100%,计算POD相对酶活。

1.7底物浓度与反应速率的关系以及POD米氏常数Km值的测定

分别配制浓度为0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%的愈创木酚溶液,测定时选用pH6.8提取的POD粗酶液,在pH6.4缓冲溶液体系、30℃下按照1.3中的方法进行测定,比较不同底物浓度下POD的活性变化。并求出相应的反应速率(以△A/min来表示),根据Lineweaver和Burk提出的双倒数法作图求出Km和Vmax值。

1.8 POD的热稳定性研究

取pH6.4磷酸缓冲溶液(0.05mol/L)20mL,2%愈创木酚溶液10mL、2%过氧化氢溶液10mL和pH6.8下提取的POD粗酶液5mL分别在30、40、50、60、70、80、90、100℃的水浴中保温30min,马上冷却至室温,再分别在30℃下保温10min,按照1.3中的方法测定不同温度下POD活性的稳定性。以最高酶活力为100%,计算POD的相对酶活。

2 结果与分析

2.1 POD最适提取pH的测定

图1所示为不同pH缓冲溶液提取的POD粗酶液测定的活性变化。由图1可知,在pH6.0～6.6之间,POD的相对酶活都保持在80%以上,在pH5.8和高于pH7.0时,POD的相对酶活下降到只有最高处pH6.4时的60%左右,因此,在以下实验中均使用pH6.4的磷酸缓冲溶液制备粗酶液。图1所示的相对酶活变化趋势表明,提取pH的升高或降低会引起酶活性的下降,在pH6.0以下酶活变化比较明显。这可能与酶的结构有关[4],酸性条件下,蛋白质结构变化造成酶活减弱,而在碱性条件下酶的结构相对稳定、活性处于休眠状态。不同来源的POD,其粗酶液的提取pH也不相同,例如荔枝果皮为pH6.6[8],板栗为pH5.5[9],大豆为pH6.0[10]等,POD的最适提取pH可能与POD的种类有关。

图1 POD的最适提取pH

2.2 POD最适反应pH的测定

为了准确地找出金柚果肉POD的最适反应pH范围,实验首先在较广泛pH(3.0～9.6)范围内进行,然后在酶活较高的pH(5.8～8.0)范围内再细分测定,图2中只表示出有代表性的点。测定的pH体系为：pH3.0～5.0,磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(0.2mol/L)；pH5.8～8.0,磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.05mol/L)；pH9.0～9.6,巴比妥钠(0.04mol/L)-盐酸(0.2mol/L)缓冲液。金柚果肉POD活性对环境pH敏感度与PPO比较,金柚果肉PPO酶活性对环境酸碱度非常敏感,当pH在6.0～6.6范围内表现出较高活性；当pH小于6.0或者大于6.6时,PPO酶活性开始下降；当pH小于5.0或者大于7.0时,活性迅速下降[3]；由图2可知,POD受环境pH的影响没那么大,在较大范围pH5.0～8.0之间,POD的相对酶活都能保持在60%以上,且在pH6.8的体系下,所测POD活性最大；当pH小于5.0或者大于8.0时,活性迅速下降；在pH为3.0和9.6时,POD活性分别有最大时的14.8%和36.1%。由此推断在金柚加工过程中,通过控制pH较难起到抑制酶活性的作用,因此要对金柚果肉POD的性质进行进一步研究,才能找到减轻其褐变的方法。

不同来源POD的最适反应pH不一样,但比较接近。如以愈创木酚为底物时,草莓[11]、葡萄[12]、和番茄[13]等果实的POD的最适pH分别为6.0、5.5和5.5。Civello等发现草莓POD在pH4.0～11.0比较稳定,低于pH3.0时POD基本失活[9]；而辣椒POD在pH6.0～9.0范围内稳定,在pH5.0以下是失活很快,而pH3.0时完全失活[14]；也有文献报道,荔枝果皮POD在pH4.0～8.0范围内稳定,在pH3.0以下完全失活[15]。

POD最适反应pH随酶的来源(不同果蔬产品)、同功酶的组成、氢供体底物及缓冲溶液等的不同而有差异。有些果蔬中POD的最适反应pH范围较宽,原因是存在不同最适反应pH的同功酶；另外,同一果蔬产品POD的可溶性部分和化学结合部分的最适反应pH可能也不同[3]。有报道分析[16],pH影响POD活性的原因如下：pH的改变会改变酶的活性中心相关基团的解离状态,从而影响酶的活性。植物所含过氧化物酶为含铁过氧化物酶,以正铁血红素III作为辅基,在pH较低的酸性环境下,酶中的铁离子能够被解离出来,使酶失活；而在碱性条件下铁离子会解离出来并生成Fe(OH)3,使酶活性显著降低。大部分来源的POD在中性偏酸的介质环境下,酶的活性最高。

图2 POD的最适反应pH

2.3 POD最适反应温度的测定

图3为PPO粗酶液和底物分别在不同温度下处理10min,再混合进行测定的效果图。由图3可知,金柚果肉POD的最适反应温度范围较广,温度在30～80℃之间活性保持较高值；在温度高于80℃时,随着温度的升高,酶活性明显降低。与其最适pH相类似,POD的最适反应温度也与酶的原料种类、果蔬品种、同功酶的组成,缓冲液的pH、酶的纯化程度等因素有关。以愈创木酚为底物,莲藕POD的最适温度为35℃[17],豆壳[18]和草莓果实[9]POD的最适反应温度分别为45℃和30℃。温度从两方面影响酶促反应的速率[19]。首先,升高温度增加底物分子的热能,增高反应的速率。然而较高的温度会带来第二种效应,即导致酶的变性。升高温度以提高反应速率的总效应是这两个相反效应之间的平衡。

图3 POD的最适反应温度

2.4底物浓度和POD活性的关系

由图4可以看出,底物在低浓度时(<4%),底物浓度和反应速率有一定的正比关系,随着底物浓度的增加,反应速率也相应地增加；当底物达到一定浓度(≥4%),底物浓度再增加,反应速率与浓度不再具有线性关系,吸光值的变化随着浓度的增大反而降低。说明金柚果肉POD以愈创木酚为底物,其最适反应浓度为4%,再增加底物浓度对酶的活性作用不大,这与Michaelis-Menten假说是相一致的,因此,可根据Lineweaver和Burk提出的双倒数法作图求出Km和Vmax值。根据实验数据求得v-1与s-1的线性回归方程为v-1=0.341 s-1+0.039,相关系数R2=0.988。即以愈创木酚为底物,在本实验的条件下(pH6.8,30℃),金柚果肉中POD的Vmax=25.64U/min,Km=8.74mmol/L(参见图5)。

在H2O2存在的情况下,POD能催化多种物质氧化并形成褐色物质[20],包括酚类、芳香胺类、还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸等[3]。愈创木酚被认为是POD的最适底物,葡萄[10]和大豆[21]POD对愈创木酚的Km分别为5.5、5.9mmol/L,豌豆[22]三种POD同功酶对愈创木酚的Km分别为10.2、10.8、10.2mmol/L,荔枝果皮[13]POD对愈创木酚的Km为2.75mmol/L,可见愈创木酚对不同来源的POD的亲和力是不一样的,同时证明了Km值的大小表示底物与酶的亲和力的大小。

图4 底物浓度与酶活的关系

图5 米氏常数的测定

2.5 POD热稳定性研究

将粗酶液、底物和H2O2分别在30、40、50、60、70、80、90、100℃保温30min后,再调至最适温度30℃测定POD活性,得到结果如图5。由图5可知,在30～80℃范围内,POD均能保持较高活性,与文献报道[23]中过氧化物酶是耐热性最强的酶之一的结论相符；当温度高于80℃处理后的酶液,活性开始迅速下降,90℃处理30min后,POD活力只有最大时的13.15%,100℃处理30min后,POD活力下降到最大时的4.7%。因此在实际生产中,应采用长时热烫处理,才能降低直至破坏果蔬组织中的POD活性,达到控制果蔬的酶促褐变的目的。

从酶分子本身来看,POD的热失活包括以下过程：全酶分子辅基的解离；脱辅基酶蛋白构象的变化；辅基的修饰或降解。不同POD同功酶的耐热性存在差异,但这种差异在很大程度上取决于酶来源于何种果蔬[3]。例如荔枝果皮[13]POD表现出较高的热稳定性,在60℃以下稳定,超过60℃酶活力开始下降,80℃处理30min尚保持39.8%的酶活力,与大豆[19]POD相似。草莓果实[9]POD在60℃仅5min就失活80%以上。控制POD热失活的主要指标是热处理的时间和温度,而在一定温度下,热处理时间足够长时会使POD的失活更完全。但长时间加热对保持果蔬的营养和风味不利,因此对于类似本文中研究的金柚果肉中这类耐热性强的POD,为达到抑制酶活的目的,除考虑加热外,还需添加其他抑制剂。

图6 POD的热稳定性

3 结论

本文较为系统地研究了金柚果肉中过氧化物酶的动力学特征及相关特性。本实验以愈创木酚为底物的结果表明：金柚果肉过氧化物酶的最适提取pH为6.0～6.6,其活性受环境pH影响较小,在pH5.0～8.0的范围内POD活性变化不大,选择pH6.8作为其最适反应pH,最适温度选择在30～80℃均影响不大,耐热实验结果表明,80℃以上处理30min POD活性才开始下降,其具有较强的耐热性。金柚果肉过氧化物酶的动力学参数Km为8.74mmol/L,Vmax=25.64U/min。

经与其他来源POD的特性比较,金柚果肉POD具有较宽的反应pH和反应温度,且具有较强的耐热性,因此在实际加工过程采取的抑制其活性的手段,除常见的调节pH和加热外,还需加入某些抑制POD活力的化合物,这部分会在以后实验中继续研究。

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Study on enzymatic characteristics of Peroxidase(POD)in pomelo

LIJie,CHENZhong*,LINWei-feng

(School of Light Industry and Food science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

Using guaiacol as substrates,the characteristics of peroxidase(POD)extracted from pomelo was studied. The results showed that the optimum extracting pH of POD was 6.4,the optimum range of temperature and pH of POD catalytic reaction were 30～80℃ and 5.0～8.0,respectively. Kmwas 8.74mmol/L and Vmaxwas 25.64U/min. The POD was inactivated when the temperature was higher than 80℃.

pomelo;peroxidase;enzymatic characteristics

2013-06-13 *通讯联系人

黎婕(1988-),女,硕士,研究方向：粮食油脂及植物蛋白工程。

TS201.2

：A

：1002-0306(2014)01-0133-04