植物多糖对断奶仔猪淋巴细胞增殖和细胞因子分泌的影响

邹 云 谢红兵 禹琪芳 李江长 何绍平 贺建华

(湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128)

植物多糖是国际上公认的天然优良的免疫调节剂、生物活性多糖或免疫活性多糖等［1］。牛膝多 糖 (Achyranthes bidentata polysaccharides，ABP)、白术多糖(Atractylodes macrocephalaon polysaccharides，AMP)和黄芪多糖(Astragalus polysaccharides，AP)因具有免疫调节、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、保护肠道、修复组织和提高动物生产性能的一系列作用，逐渐成为当前研究热点。本课题组前期研究发现，ABP能促进仔猪血清淋巴细胞转化率和细胞因子肿瘤坏死因子(tumor necrosis factors，TNF)、白细胞介素 -1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素 -2(interleukin-2，IL-2)、白细胞介素 -6(interleukin-6，IL-6)、分泌［2］。朱南山等［3］试验表明 AMP对仔猪血淋巴细胞转化及信号转导相关分子均能产生积极的影响。Liu等［4］研究发现AP能诱导脾脏树突状细胞分化，促使辅助性 T细胞2(helper T cell 2，TH2)向辅助性T细胞1(helper T cell 1，TH1)转化，从而增强T淋巴细胞免疫功能。但以前的试验多集中在单一多糖的研究上，对不同多糖之间效果的比较及几种多糖的联合使用很少见。为此，本文就3种多糖在相同条件下单独或联合使用对仔猪外周血淋巴细胞转化率和血清细胞因子含量的影响进行研究，为阐明3种多糖对仔猪免疫调控的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选用256头28日龄的杜长大(杜洛克×长白×大白，Duroc×Landrace×Yorkshire)断奶仔猪，采用3因素2水平(2×2×2)试验设计，按体重相近原则随机分为8个处理，每个处理4个重复，每个重复8头仔猪，ABP、AMP、AP添加水平分别为0、800 mg/kg。试验设计见表1，处理1(即对照组)饲喂基础饲粮，处理2～8(即试验组)饲喂在基础饲粮中分别添加不同水平多糖的试验饲粮。试验第14天和第28天09:00每重复随机挑选1头猪，无菌前腔静脉采血，分别注入真空肝素钠抗凝管和真空管制成抗凝血和血清。采用噻唑蓝(MTT)法测定外周血淋巴细胞转化率。采用酶联免疫吸附测定试验(ELISA)测定血清细胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF、干扰素 - γ(interferon-γ，IFN-γ)含量。

表1 试验设计Table 1 Experimental design mg/kg

1.2 试验材料

试验多糖来源于西安天园生物制剂厂，ABP由果糖和葡萄糖组成，AMP主要成分为甘露聚糖和果聚糖，AP由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成。ABP、AMP、AP 有效含量分别为 60%、60% 和65%，折算后纯的3种多糖添加到饲粮中的量为800 mg/kg。

1.3 基础饲粮

参照NRC(1998)仔猪营养需要量标准，并结合生产实践配制基础饲粮，其组成及营养水平见表2。

1.4 饲养管理

动物饲养试验在湖南省益阳市农业科学研究所沅江猪场内进行，采取自由采食、饮水，免疫消毒程序按猪场常规方法进行。

1.5 测定指标

1.5.1 仔猪外周血淋巴细胞转化率的测定

淋巴细胞转化试验采用MTT法，应用非特异性有丝分裂原植物血凝素(PHA)作为刺激物。具体操作参照何昭阳等［5］的测定方法。取新鲜抗凝血1 mL，与全血稀释液1∶1混匀后，小心加于4 mL淋巴细胞分离液液面之上，以2 500 r/min离心15 min，吸出位于血浆层下的白膜层，用3～5倍体积无小牛血清RPMI 1640培养液洗2次，每次以2 000 r/min离心10 min，用台盼蓝染色计数，活细胞在95%以上，用含10%小牛血清RPMI 1640完全培养液配成3×106个/mL单细胞悬液。置于37℃细胞培养箱中培养。过夜培养后丢弃贴壁的单核细胞，获得外周血淋巴细胞，并配成2×106个/mL淋巴细胞悬液。用96孔细胞培养板培养，试验孔每孔加入2×106个/mL淋巴细胞悬液100μL和 PHA 液 100 μL，PHA 终 浓 度 为25μg/mL，对照孔每孔加入淋巴细胞悬液100μL和RPMI 1640培养液100μL，每个处理设5个观察值，置于37℃、5%CO2培养箱内培养44 h，接着每孔加入5 mg/mL MTT溶液20μL，继续孵育4 h，终止培养，小心弃去各孔上清液，再每孔加入150μL二甲基亚砜，在微型振荡器上震荡10 min，使MTT充分溶解。用酶标仪测每孔OD570nm值。以刺激指数(stimulation indices，SI)值高低反映淋巴细胞转化率的高低，其计算公式为:SI=PHA刺激孔OD平均值/对照孔OD平均值。

表2 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.5.2 仔猪血清细胞因子含量的测定

采用ELISA试剂盒测定血清细胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF、IFN-γ 的含量，按照试剂盒说明书中的方法和步骤进行测定。试剂盒由武汉华美生物工程有限公司提供。

1.6 数据处理

试验数据采用SAS 9.2软件的GLM过程进行析因分析，试验结果用平均值±标准差表示，用Duncan氏法进行多重比较，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 ABP、AMP、AP对断奶仔猪外周血淋巴细胞转化率的影响

由表3可知，试验处理对试验第14天和第28天时断奶仔猪的外周血淋巴细胞转化率有显著影响(P＜0.05)，与对照组相比，单独或联合添加多糖组断奶仔猪的外周血淋巴细胞转化率都显著提高(P ＜0.05)。试验第14天时，ABP、AMP、AP两两合用较单独添加ABP或者AMP有提高淋巴细胞转化率的趋势，但差异不显著(P＞0.05)，AMP与AP或ABP合用较单独添加AP有显著提高(P ＜0.05)。试验第28天时，ABP、AMP、AP两两合用较单独添加1种多糖的淋巴细胞转化率有所提高，但差异也不显著(P＞0.05)。试验第14天和第28天时，3种多糖合用时淋巴细胞转化率显著高于单独添加1种多糖(P＜0.05)，较两两合用组有不同程度提高(P＞0.05)。试验第28天各组的淋巴细胞转化率与试验第14天相比均呈现下降趋势。析因分析表明，ABP、AMP、AP极显著提高了断奶仔猪外周血淋巴细胞转化率(P＜0.01)，3种多糖两两或三者合用对断奶仔猪外周血淋巴细胞转化率有提高趋势(P＞0.05)，但相互之间未体现出互作效应(P＞0.05)。

2.2 ABP、AMP、AP对断奶仔猪血清细胞因子含量的影响

2.2.1 ABP、AMP、AP对试验第14天断奶仔猪血清细胞因子含量的影响

由表4可知，试验第14天时，添加多糖组断奶仔猪血清细胞因子 IL-2、IL-1β、TNF、IFN-γ 的含量显著高于对照组(P＜0.05)，IL-6的含量有一定程度提高，但单独添加1种多糖时与对照组差异不显著(P＞0.05)，只有两两合用或三者合用时才显著高于对照组(P＜0.05)。ABP、AMP、AP两两合用较单独添加其中1种多糖的细胞因子IL-6含量有显著提高(P ＜0.05)，对 IL-1β、IL-2、TNF 有不同程度提高，但差异不显著(P＞0.05)。3种多糖两两合用较单独添加AP或AMP可显著提高IFN-γ含量(P＜0.05)。3种多糖合用时细胞因子IL-2、IL-6、TNF、IFN-γ 的含量显著高于单独添加 1种多糖(P＜0.05)，较两两合用有不同程度提高。析因分析表明，ABP极显著提高了试验第14天断奶仔猪细胞因子 IL-2、IL-1β、IL-6、TNF、IFN-γ 的含量(P＜0.01)。AP极显著提高了试验第14天断奶仔猪细胞因子 IL-2、IL-6、TNF、IFN-γ 的含量(P＜0.01)，显著提高了IL-1β含量(P＜0.05)。AMP极显著提高了试验第14天断奶仔猪细胞因子 IL-1β、IL-6、TNF、IFN-γ 的含量(P ＜ 0.01)，显著提高了IL-2含量(P＜0.05)。联合使用3种多糖对提高断奶仔猪血清IL-6含量具有极显著的互作效应(P ＜0.01)，但对提高IL-2、IL-1β、TNF、IFN-γ含量相互之间未体现出互作效应(P＞0.05)。

表3 ABP、AMP、AP对断奶仔猪外周血淋巴细胞转化率的影响Table 3 Effects of ABP，AMP and AP on lymphocyte proliferation in peripheral blood of weaner piglets

2.2.2 ABP、AMP、AP对试验第28天断奶仔猪血清细胞因子含量的影响

由表5可知，试验第28天时，单独或联合添加多糖组断奶仔猪血清的细胞因子 IL-2、IL-1β、TNF、IFN-γ的含量与对照组相比都显著提高(P＜0.05)，IL-6含量有一定程度提高，但单独添加1种多糖时与对照组差异不显著(P＞0.05)，仅在两两合用或三者合用时才显著高于对照组(P＜0.05)。ABP、AMP、AP两两合用组较单独添加其中1种多糖组的TNF、IL-1β、IFN-γ含量有显著提高(P＜0.05)，对IL-2、IL-6含量有不同程度提高，但差异不显著(P＞0.05)。3种多糖合用组的IL-6、IL-1β、TNF、IFN-γ 的含量显著高于单独添加 1种多糖组(P＜0.05)，较两两合用组有不同程度提高。析因分析表明，ABP、AMP、AP极显著提高了断奶仔猪试验第28天细胞因子IL-1β、IL-6、TNF、IFN-γ的含量(P＜0.01)，ABP显著提高了 IL-2含量(P＜0.05)。ABP和AMP对提高断奶仔猪试验第28天血清TNF含量具有极显著的互作效应(P＜0.01)。AP和AMP对提高断奶仔猪试验第28天血清IL-1β含量具有显著的互作效应(P＜0.05)。3种多糖对提高断奶仔猪血清IL-2、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量相互之间未体现出互作效应(P＞0.05)。

表4 ABP、AMP、AP对试验第14天断奶仔猪血清细胞因子含量的影响Table 4 Effects of ABP，AMP and AP on serum cytokine contents of weaner piglets on the 14th day of the experiment

3 讨论

3.1 3种植物多糖对断奶仔猪外周血淋巴细胞转化率的影响

淋巴细胞增殖是反映机体细胞免疫水平的一个重要指标［6］。目前已有许多试验表明多糖可通过促进淋巴细胞转化和增殖等途径发挥免疫调节作用。陈清华等［2］研究发现饲粮中添加ABP可以显著提高仔猪外周血淋巴细胞转化率和血清中TNF、IL-1β、IL-2、IL-6 等细胞因子的含量，且存在一定的量效和时效关系。李宗锴等［7］通过体外研究表明ABP能提高老年小鼠T淋巴细胞的增殖能力。李丽立等［8］研究显示饲粮中单独添加白术纯多糖、复合粗多糖显著提高了早期断奶仔猪淋巴细胞转化率。陈洪亮等［9］研究表明AP对雏鸡外周血T淋巴细胞转化功能有增强作用，且与对照组差异显著。毛晓峰［10］研究表明AP显著地提高了断奶仔猪淋巴细胞转化率和IL-2的活性。范云鹏等［11］研究表明，与对照组相比，AP组能显著促进鸡T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖。本试验结果表明，单独或联合添加多糖组断奶仔猪的外周血淋巴细胞转化率与对照组相比都显著提高，3种多糖两两合用较单独添加1种多糖的淋巴细胞转化率有所提高，但差异不显著，3种多糖合用时淋巴细胞转化率显著高于单独添加1种多糖，较两两合用有不同程度提高。但3种多糖相互之间未体现出互作效应。这与等研究结果相类似，AP和ABP对应激仔猪外周血淋巴细胞增殖没有体现出互作效应。这可能由于3种多糖的特性和试验动物生理反应的复杂性造成，3种多糖对断奶仔猪是否具有互作效应仍需进一步研究。

表5 ABP、AMP、AP对试验第28天断奶仔猪血清细胞因子含量的影响Table 5 Effects of ABP，AMP and AP on serum cytokine contents of weaner piglets on the 28th day of the experiment

3.2 3种植物多糖对断奶仔猪外周血细胞因子分泌量的影响

细胞因子是由淋巴细胞、单核-巨噬细胞以及相关免疫细胞产生的具有免疫调节功能的一类蛋白类物质，是免疫系统重要的信息分子。近年来研究发现，多糖有促进细胞因子产生的作用，其中 IL-2、IL-6、IL-1β、TNF、IFN-γ 在免疫应答中充当着十分重要的角色。IL-2由活化的T淋巴细胞产生，又叫T细胞生长因子，具有广谱的免疫增强活性。IL-6在B细胞生长分化时起关键作用，又称为B细胞生长因子。IFN-γ主要介导TH1型反应，促进IL-2分泌释放，促进T细胞的分化增殖。TNF能活化单核细胞和巨噬细胞，提高其杀伤活性，也可增强T细胞、自然杀伤细胞等活性以及产生IL-1、IL-6等细胞因子。IL-1β能促进胸腺细胞、T细胞的活化、增殖和分化，增强B细胞功能以及刺激单核细胞核巨噬细胞产生IL-6和TNF。本试验测定了仔猪血清细胞因子 IL-2、IL-6、IL-1β、TNF、IFN-γ 的含量，结果显示，试验第 14天和第28天，添加多糖组细胞因子 IL-2、IL-1β、TNF、IFN-γ的含量显著高于对照组，虽然单独添加1种多糖时IL-6含量与对照组差异不显著，但也有一定程度提高，两两合用或三者合用时显著高于对照组。这表明3种多糖单独或联合使用均能在一定程度上促进仔猪细胞因子产生。这与近年来的一些同类研究结果基本一致:Li等［12］报道饲粮中添加纯AMP显著提高了断奶仔猪血清中IL-1、TNF-α、INF-γ 含量;Zhuge 等［13］报道 ABP 上调了外周血单个核细胞IL-2 mRNA表达;Fan等［14］研究报道添加AP显著提高了鸡血清中IFN-γ和IL-2含量;Li等［15］研究报道AP极显著地提高了小鼠脾淋巴细胞增殖和血清中IL-2含量，且存在一定的量效关系;Qiu等［16］研究表明AP可有效促进血清中 IL-2、IFN-γ 的分泌;Zhu等［17］研究表明ABP能提高老鼠血清中IFN-γ、TNF-α含量，增强TH1型免疫应答来控制疟疾的扩散;Jin等［18］研究表明 ABPS能显著上调老鼠脾脏 IL-6 mRNA 和 TNF-α mRNA 表达量;Guo等［19］研究表明饲粮中补充ABP能调节细胞因子的释放，缓解了断奶仔猪的免疫应激;Chen等［20］研究表明给仔猪补充ABP提高了肝脏、空肠黏膜和肠系膜淋巴结IL-1 mRNA转录水平。由此推论，饲粮中添加ABP、AP、AMP 能提高仔猪血清中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF、IFN-γ含量，促进淋巴细胞和单核细胞增殖，提高仔猪免疫性能。本试验中ABP、AMP、AP两两合用都较对照组在不同程度上提高了淋巴细胞增殖和细胞因子含量，3种多糖合用在一些指标上优于单独添加组，体现出一定的互作效应。3种多糖联合使用对提高试验第14天断奶仔猪血清IL-6含量具有显著的互作效应。ABP和AMP合用对提高试验第28天断奶仔猪血清TNF含量具有显著的互作效应。AP和AMP合用对提高试验第28天断奶仔猪血清IL-1β含量具有显著的互作效应。但3种多糖合用在某些指标上未能体现出互作效应，如在淋巴细胞增殖上并未体现出一定的互作效应，可能与它们的水平组合、试验的测定误差等因素有关，也可能因为本次试验3种多糖水平梯度少导致它们之间的相互作用不能很好地体现。

本试验还发现，与试验第14天相比，第28天的断奶仔猪外周血淋巴细胞转化率降低，并且IL-2、IFN-γ、IL-6含量也有降低趋势，这可能是因为多糖的免疫调节作用受时间影响，随着时间延长，细胞对多糖再次的刺激反应下降;也可能是因为在试验前14天，仔猪处于应激较强，免疫机能较弱期，添加多糖能迅速发挥免疫调节作用，而试验第15～28天时，仔猪免疫机能逐渐完善，吸收的营养物质可能主要用于生长。

4 结论

①饲粮中单独添加ABP、AP、AMP可以显著提高仔猪外周血淋巴细胞转化率和血清细胞因子IL-2、IL-1β、IFN-γ 和 TNF 的含量。

②3种多糖两两合用或三者合用显著提高了外周血淋巴细胞转化率和血清细胞因子IL-2、IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF 的含量。

③ABP、AP、AMP组合添加对提高断奶仔猪血清中细胞因子的含量体现出一定的互作效应。

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