含多酸化合物新型洗手液抗甲型流感病毒效果及毒性评价

佟 瑶，张毛毛，李 丽，殷德辉，曲笑锋，齐燕飞，李 娟，徐 坤（.吉林大学公共卫生学院卫生检验教研室，吉林 长春 300；.东北师范大学化学系 多酸科学教育部重点实验室，吉林 长春 3004）

甲型H1N1流感病毒宿主范围广，容易发生抗原漂移和抗原变异，常引发世界范围的大流行[1]，其所致的急性呼吸道传染病人群普遍易感，导致全球范围18 000人死亡[2]。接种疫苗是预防和控制甲型流感最经济有效的措施，但是一些人在接种疫苗后出现不同程度的不良反应[3]，由于血凝素（HA）抗原不断发生变异，人体内产生的抗体并不能持续有效预防甲型流感。甲型流感病毒主要通过呼吸道飞沫和接触途径传播，良好的个人卫生习惯和经常洗手是预防该疾病的有效方法[4]。澳大利亚和美国的学者分别在2009年和2012年，使用美国标准方法研究其国内手部消毒产品的抗病毒效果，结果显示这些产品能有效清除手部流感病毒[5－6]，预防疾病发生。国内尚未见类似产品及其效果方面研究，因而研制具有抗甲型H1N1流感病毒作用的洗手液对预防控制甲型流感流行具有十分重要的意义。多酸化合物是一类前过渡金属氧阴离子簇，这类物质在体内外表现出对RNA病毒、DNA病毒的良好抑制作用，且毒性低[7－11]，但在生物体内应用的效果不理想，体表应用也许是发展方向。本文作者设计合成了一种以多酸为有效成分的洗手液，并对其抗甲型H1N1流感病毒效果和安全性进行评价，以期为开发具有抗甲型H1N1流感病毒作用的洗手液奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样 品

多酸化合物K10Na [（VO）3（SbW9O33）2]·26H2O（PM-1001）和 K15[Pr（BW11O39）2]·28H2O（Pr-B）由东北师范大学化学学院和吉林大学公共卫生学院按照相关文献[12－13]合成。含多酸成分的新型洗手液由吉林大学公共卫生学院合成。

1.2 细胞株与病毒株

MDCK细胞株和甲型H1N1流感病毒（A/XD/01/2009）由解放军军事医学科学院军事兽医研究所提供。

1.3 实验动物

健康昆明小鼠20只，雌雄各半，体质量（20±2）g，购自吉林大学实验动物中心。健康白色家兔3只，1～2月龄，体质量（2.0±0.2）kg，购自吉林大学实验动物中心。

1.4 多酸化合物体外抗病毒活性

在长满单层MDCK细胞的96孔板中加入用DMEM培养液分别稀释的2种多酸化合物，剂量分 别 是 5 000.000、2 500.000、1 250.000、625.000、312.500、156.250和78.125mg·L－1，对照组仅加入培养液，每组4复孔。在37℃、5%CO2饱和湿度条件的温箱中培养48h后，采用MTT法测定细胞存活量，计算最大无毒浓度（TC0）、半数中毒浓度（TC50）和90%中毒浓度（TC90）。

96孔板中的MDCK细胞长满单层后，弃掉其中液体，分为3组。①正常细胞对照组：仅加入DMEM培养液；②病毒对照组：加入含100倍组织培养半数感染剂量（TCID50）浓度病毒的培养液；③实验组：分别将PM-1001和Pr-B从TC0浓度开始2倍稀释为8个浓度，加入100TCID50浓度病毒感染的MDCK细胞中，每组4复孔。培养板在37℃、5%CO2和饱和湿度条件的温箱中培养，连续观察，48h后采用MTT法检测细胞存活量，计算半数抑制浓度（IC50）和治疗指数（TI）。TI＝ TC50/IC50）。

1.5 含多酸新型洗手液抗甲型流感病毒效果评价

选择10名志愿者，签署书面知情同意书，随机分为2组，在试验过程中手部皮肤无破损，试验前1周手部不使用任何含有抗菌剂成分的物质。试验前，志愿者用普通洗手液，按照六步洗手法洗手15s，用无菌纱布擦干，在手心加75%酒精1.5mL，反复摩擦整个手部至酒精晾干。用冻存管在指腹上按压一个约为8mm的范围，在其中涂抹107.5TCID50/0.1mL（含5%胎牛血清，作为有机干扰物）的病毒悬液0.02mL，晾干。每名志愿者的10个手指随机分为5对，其中1对手指加病毒液后立即用0.4mL培养液洗脱病毒，1对手指为对照组，病毒液晾干后直接用0.4mL培养液回收，剩余3对手指为实验组，分别依次接触0.4mL含高、中、低浓度多酸的洗手液和0.4mL标准硬水，然后用0.4mL培养液洗脱病毒。以上各种液体均加入到2mL冻存管中，管口按照按压痕迹接触涂抹病毒液的区域。以上操作均在生物安全柜中进行。使用MCDK细胞检测洗脱液中病毒的TCID50，与对照组比较，计算洗手液实际减少的病毒量。实际减少的病毒量＝log10TCID50（对照组）－log10TCID50（实验组）。

1.6 甲型流感病毒在人手部存活能力检测

选择2名志愿者，签署书面知情同意，准备工作与1.5相同。志愿者的10个手指随机分为5对，其中1对为对照组，病毒液晾干后直接用0.4mL培养液回收；2对手指在病毒液晾干30min后，使用0.4mL培养液回收；2对手指在病毒液晾干60min后，使用0.4mL培养液回收。使用MCDK细胞检测洗脱液中病毒的TCID50，与对照组比较，计算洗手液实际减少的病毒量，计算方法同1.5。

1.7 含多酸成分的新型洗手液安全性评价

1.7.1 小鼠急性经口毒性实验 昆明小鼠20只，雌雄各半，动物室适应性饲养7d，无异常。灌胃前禁食过夜，不限制饮水，按照5 000mg·kg－1体质量给予洗手液（浓度约1.25g·mL－1）。给药后连续观察14d，每天记录体质量和一般状态，第14天处死小鼠，解剖后观察骨骼及脏器是否异常。

1.7.2 家兔完整皮肤刺激实验 家兔3只，动物室适应性饲养7d，无异常。试验前24h用脱毛机将家兔背部脊柱两侧的毛去掉，面积为3cm×3cm。取0.5mL洗手液涂抹于面积为2.5cm×2.5cm的一侧去毛完整皮肤上，盖保鲜膜，用医用胶布固定，2h后用温水除去残留洗手液。另一侧皮肤作为空白对照。分别于去除洗手液后1、24和48h观察皮肤局部反应，记录结果。按 《消毒技术规范》（2008版）中的方法计算刺激指数。

1.7.3 家兔急性眼刺激实验 吸取0.1mL洗手液滴入家兔一侧眼结膜囊内，另一侧以生理盐水作为正常对照。将眼被动闭合4s，30s后用生理盐水冲洗。于滴眼后1h、24h、48h、72h、7d、14d和21d观察家兔眼结膜、虹膜和角膜的损伤与恢复情况。按 《消毒技术规范》（2008版）中的方法计算眼刺激评分。

1.8 统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。各组洗脱液中病毒浓度以10x±sTCID50/0.1mL 表示，对log10TCID50进行统计分析，病毒浓度组间比较采用独立样本t检验，对照组、30min回收病毒组和60min回收病毒组间病毒浓度比较采用方差分析和SNK法。

2 结 果

2.1 多酸化合物体外抗病毒活性研究

2种多酸化合物PM-1001和Pr-B体外抗甲型H1N1流感病毒的TI分别是82.68和69.13，结果见表1。按2种化合物TC0、（TC0＋EC50）/2和EC50浓度配制成高、中、低剂量洗手液。

2.2 含多酸新型洗手液抗甲型H1N1流感病毒的效果评价

接触手指后直接回收的病毒浓度平均为104.33±0.66TCID50/0.1mL，对照组病毒浓度平均为104.29±0.41TCID50/0.1mL，使用 含 2 种 多 酸 的 高、中、低剂量洗手液后，细胞培养法均未检测出病毒残留，各洗手液组病毒浓度与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.001），各洗手液组间病毒浓度比较差异无统计学意义（P＞0.05）。含2种多酸不同剂量的洗手液均具有良好的清除人手部甲型流感病毒的活性，各洗手液效果比较无明显差异。见表2。

表1 2种多酸化合物对MDCK细胞毒性和抗病毒效果Tab.1 Toxicities and anti-viral effects of two compounds on MDCK cells against H1N1

表2 含2种多酸洗手液对甲型流感病毒的抑制效果Tab.2 Efficacies of two hand-washing agents against H1N1 influenza virus （n＝5）

2.3 甲型流感病毒在人手部存活能力检测

对照组病毒浓度对数平均数为104.29±0.40TCID50/0.1mL，晾干后30和60min回收病毒的浓度对数平均数分别为103.98±0.42TCID50/0.1mL和103.83±0.35TCID50/0.1mL，各组病毒浓度比较差异无统计学意义（P＞0.05），病毒在手部60min存活能力无明显变化。见表3。

表3 甲型流感病毒在人手部30和60min存活能力Tab.3 Survival abilities of H1N1influenza virus on human hands for 30and 60min （n＝4）

2.4 含多酸成分新型洗手液的安全性评价

选择含有高剂量PM-1001的洗手液进行毒性实验。①小鼠急性经口毒性实验：灌胃给予洗手液后，小鼠状态未见异常，14d内无死亡，第14天处死小鼠，解剖观察骨骼及脏器均未见异常。含有高剂量PI-1001的洗手液小鼠经口毒性的半数致死浓度（LD50）＞5 000mg·kg－1（体质量），属实际无毒级物质。②家兔完整皮肤刺激实验：洗手液可以使家兔皮肤出现勉强可见的红斑，无水肿现象，皮肤刺激指数最高为0.33，出现在去掉洗手液1h时，然后逐渐恢复，2h内可完全恢复。含有高剂量PM-1001的洗手液皮肤刺激指数小于0.5，属于无刺激性洗手液。③家兔急性眼刺激实验：加入洗手液时，家兔无刺激反应。洗手液可使家兔出现结膜充血和结膜轻微水肿，72h内完全恢复，对3只家兔眼刺激的平均评分分别为0、0.67和0.33。含有高剂量PM-1001的洗手液对家兔眼造成的损伤是可逆性，属无刺激性物质。

3 讨 论

本研究结果显示：甲型H1N1流感病毒在人手部 60min后滴度为 103.83±0.35TCID50/0.1mL，与对照组比较无显著差异，表明病毒在自然条件下，可以在手部存活60min以上，手可能成为携带病毒和传播病毒的媒介；使用洗手液后，细胞培养法未检测到病毒，说明手部此时已无活病毒存在或者活病毒量极低，证明洗手液可以有效除去手部的病毒，阻断流感病毒通过手部接触的传播。本研究结果显示：该洗手液配方温和，对动物皮肤和眼部均无刺激，对家兔进行刺激实验时，家兔无明显的挣扎抵抗，对小鼠进行灌胃后，小鼠未出现不良反应，体质量增加无异常，这与同类研究[14－15]得到的结论一致。其中加入的有效成分PM-1001在体外实验中，对登革热病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ型、免疫缺陷病毒和副流感病毒等均表现出良好的抗病毒作用[16]。根据本研究结果推断：将PM-1001加入洗护产品中，可能对上述病毒均具有良好的作用效果。这种将多酸化合物应用在体表的方法，避免了多酸应用于体内的诸多不确定因素和安全问题，可以更简单有效地发挥出多酸卓越的抗病毒特性。本研究初步探索了多酸与外用洗液联合作用的抗病毒效果，为进一步研制含有多酸化合物的外用洗液、药物等提供了依据。

[1]肖越胜，宿春虎，黄 瑶，等.扬州市近3年新型甲型H1N1流感病毒HA基因分析 [J].扬州大学学报：农业与生命科学版，2013，34（1）：36-40.

[2]赵 禹，杜彦丹，张晓光.医务人员接种甲型H1N1流感疫苗抗体水平的长期随访分析 [J].调查研究，2013，10（18）：125-127.

[3]陆顺顺，孟俊杰，桑芸璐.甲型H1N1流感疫苗的研究及应用 [J].西部医学，2013，25（2）：319-320.

[4]袁慧燕.关于甲型H1N1流感病毒预防及控制措施 [J].中国医药指南，2013，11（16）：778-779.

[5]Lindsay Grayson M，Melvani S，Druce J，et al.Efficacy of Soap and water and alcohol-based hand-rub preparations against live H1N1influenza virus on the hands of human volunteers [J].Clin Infect Dis，2009，48（3）：285-291.

[6]Larson EL，Cohen B，Baxter KA.Analysis of alcohol-based hand sanitizer delivery systems：Efficacy of foam，gel，and wipes against influenza A（H1N1）virus on hands [J].Am J Infect Control，2012，40（9）：806-809.

[7]Yamase T.Anti-tumor，-viral，and -bacterial activities of polyoxometalates for realizing an inorganic drug [J].J Mater Chem，2005，15：4773-4782.

[8]Flütsch A，Schroeder T， Grütter MG，et al. HIV-1 protease inhibition potential of functionalized polyoxometalates[J]. Bioorg Med Chem Lett， 2011，21（4）：1162-1166.

[9]Qi YF，Zhang H，Wang J，et al.Invitroanti-hepatitis B and SARS virus activities of a titanium-substitutedheteropolytungstate [J].Antiviral Res，2012，93（1）：118-125.

[10]刘 杰，梅文杰，计亮年.多金属氧酸盐抗病毒药物研究 [J].化学进展，2006，18（1）：114-119.

[11]原 野，李金华，王 娟，等.新型多酸化合物NCW-6的毒理学安全性评价 [J].吉林大学学报：医学版，2012，38（1）：28-32.

[12]Yamase T，Botar B，Ishikawa E，et al.Chemical structure and intramolecular spin-exchange interaction of[（VO）3（SbW9O33）2]12－ [J]. Chem Lett， 2001，30（1）：56-57.

[13]刘 杰，王恩波，周云山，等.稀土杂多配合物的合成及抗流感病毒的活性研究 [J].药学学报，1998，33（7）：544-547.

[14]胡永成，谭剑斌，李 志，等.盐酸聚六亚甲基胍消毒洗手液的亚急性毒性研究 [J].中国热带医学，2007，7（9）：1700-1701.

[15]刘仲霞，孙贵娟，傅伟忠.一种竹盐洗手液抗菌性能和毒性试验研究 [J].中国消毒学杂志，2013，30（6）：506-508.

[16]Shigeta S，Mori S，Kodama E，et al.Broad spectrum anti-RNA virus activities of titanium and vanadium substituted polyoxotungstates[J].Antiviral Res，2003，58（3）：265-271.