不同表面形貌的纯钛种植体对牙龈软组织界面影响的扫描电镜观察

李家奇，孟维艳，周延民，蔡 青，阿 兰，付 丽，李保胜，王世振

（1.吉林大学口腔医院种植中心，吉林 长春 130021；2.山东省德州市人民医院口腔科，山东 德州 253000）

种植义齿已成为全口或部分牙齿缺失修复的主要手段，并且有较高的成功率[1]。种植义齿的成功与否不仅取决于良好的骨结合，软组织封闭对于种植修复的长期成功率来说也是极其重要的[2]。软组织可形成种植体周围的生物学封闭，从而保护下面的骨组织免受微生物的侵袭。一些体外和动物实验研究[3]已证实：种植体表面的微形貌是影响成纤维细胞黏附和分化的关键因素。相对于光滑表面，不同的表面处理方法得到的的粗糙表面可改变上皮细胞和成纤维细胞的形态、增殖和基因表达[4]，对于提高软组织的整合有显著优势，可阻止牙龈根方迁移和细菌的入侵，从而提高软组织稳定性和封闭作用，减少骨吸收[5]。研究[6－7]还发现：与光滑表面相比，具有微米－纳米表面的种植体可诱导成纤维细胞黏附和改变胶原纤维方向，促进牙龈组织的黏附，并且纳米表面可以调节成纤维细胞的炎症反应。本研究旨在通过比较光滑表面与微米－纳米表面对软组织的影响，寻找出一种可促进牙龈软组织附着的纯钛表面形貌，并为今后种植体颈部设计提供指导。

1 材料与方法

1.1 实验试件的制备

圆柱形纯钛试件（D 3mm×11mm，莱顿北京生物材料制品公司提供）40个，使用砂纸（耐水砂纸600目、耐水砂纸320目、不耐水砂纸320目、不耐水砂纸160目）依次对钛柱表面进行打磨，再使用不同溶液（丙酮、无水乙醇和蒸馏水）对钛件依次冲洗10min。试件随机分成4组，每组10个。光滑组（S组）：不做任何处理；酸蚀组（AE组）：用一定浓度（1∶199）氢氟酸对钛柱轴面进行2min酸蚀处理；电化学腐蚀组（ECE组）：用自制电解仪对钛柱轴面进行直流电化学处理，采用不同浓度（0.1～17.0mol·L－1）氢氟酸得到2种不同表面，分别为ECE1和ECE2组；电化学腐蚀加酸蚀组（ECA组）：在ECE2组处理的基础上再用一定浓度（1∶199）氢氟酸对钛柱轴面进行2min酸蚀处理。处理过的种植体再经上述3种溶液依次超声清洗10min，高温（121.3℃）、高压（1.05kg·cm－2）20min灭菌后备用。

1.2 实验动物

健康成年杂种犬（吉林大学和平小区动物医院实验中心提供）6只，雌、雄各半，体质量12～14kg。

1.3 方 法

犬以速眠新注射液（吉林大学和平校区动物医院提供）肌肉注射（0.1mL·kg－1），麻醉成功后，口腔消毒，口外铺巾，局部黏骨膜下注射2%利多卡因。采用微创拔牙器械拔除犬右侧下颌第一和第二前磨牙、左侧第一前磨牙。甲硝唑和生理盐水反复冲洗拔牙创，采用即刻种植＋非埋植种植术，用组合钻（钻速＜1 500r·min－1）逐级备孔，按预定顺序植入5枚种植体（即S组、AE组、ECE1组、ECE2组和ECA组各1颗），顶端高于黏膜3mm，扭力达到30N。种植体均无咬合接触，紧密缝合牙龈。术后每天肌注青霉素80万U，连用5d。每天用1%洗必泰液擦洗口腔1次，连擦7d。各组犬均予软饲料喂养。缝合线任由脱落。种植术后20d时处死3只，3个月时处死3只。

1.4 扫描电镜标本制备

用锯条取下含种植体的下颌骨块，用片锯修建成1cm×1cm×1cm骨、牙龈和种植体联合标本，以0.1mol·L－1磷酸缓冲液冲洗，固定于3%戊二醛2d。用Leica SP1600锯式切片机从种植体中心位置沿纵轴切割，取一半标本以0.1mol·L－1磷酸缓冲液冲洗15min，0.5%锇酸固定1h，再以0.1mol·L－1磷酸缓冲液15min，50%、70%、80%、90%和95%酒精逐级脱水各15min。真空干燥法干燥，喷金，扫描电镜（SEM）观察牙龈与种植体结合界面，然后再机械拉除软组织，观察种植体表面和软组织黏附于种植体的组织面。

2 结 果

2.1 种植体表面扫描电镜观察

S组低倍镜下（×180）观察种植体表面较光滑（图1A）；高倍镜下（×20 000）见较浅的沟纹（图1B）。AE组低倍镜下（×500）观察种植体表面微粗糙（图1C）；高倍镜下（×50 000）可见均匀密集的纳米突，为20～100nm的圆钝突起（图1D）。ECE1组低倍镜下（×40）见种植体表面粗糙，并可见均匀的凹孔（图1E）；高倍镜下（×500）见直径约30～80μm圆形或椭圆形浅碟状凹（图1F），10 000倍镜下见凹的表面呈蜂窝状，边缘不规则（图1G）。ECE2组低倍镜下（×200）见均匀细腻的微粗糙种植体表面（图1H）；高倍镜下（×500）见分布均匀的微米凹，该微米凹为圆形或椭圆形浅碟状凹，凹内含有散在的小孔（图1I）；2 000倍镜下可见微米凹的直径约10～25μm（图1J）。ECA组低倍镜下（×50）可见种植体表面均匀细腻，微粗糙形态（图1K）；200倍镜下见分布均匀的微米－纳米表面，该表面的微米凹为圆形或椭圆形浅碟状凹，直径约10～25μm，边缘圆钝，表面可见白色粒状物质形成，即纳米突（图1L）；该纳米突在40 000倍镜下可见均匀分布于微米凹的表面，呈直径约20～80nm的半球形突起（图1M）。

图1 各组种植体表面扫描电镜图Fig.1 SEM pictures of implant surface in various groups

2.2 种植体及种植体周围软组织观察

本组共有2只种植体松动，分别于术后3和5d时脱落。余下种植体周围牙龈无红肿，软组织为粉红色，较致密。种植体无松动，种植体周围有少量软垢。3个月时周围牙龈粉红致密，无红肿，紧密包绕种植体周围。种植体无松动，周围有少量软垢。

2.3 牙龈扫描电镜观察

2.3.1 种植体－上皮组织界面 扫描电镜下观察，各组犬牙龈上皮断面呈层状，表面角化层明显，20d时结合上皮与种植体表面连接紧密，各组间比较未见明显差异（图2）；3个月时，上皮组织更加致密，上皮组织紧密附着在种植体表面，各组间未见明显差异，但其厚度明显大于生长20d时（图3）。

2.3.2 种植体－结缔组织界面 20d时，S组结缔组织与种植体大部分开裂分离，胶原纤维伸向种植体表面时与种植体表面平行排列（图4A）；AE组也可见结缔组织与种植体部分开裂，胶原纤维呈树枝状，胶原纤维根部与种植体表面紧密垂直接触（图4B）；ECE1组结缔组织开裂较少，胶原纤维比酸蚀组浓密，胶原纤维垂直紧密附着在种植体表面，呈簇状（图4C）；ECE2组结缔组织开裂也较少，胶原纤维方向比较杂乱，呈网状垂直扎向种植体表面（图4D）；ECA组胶原纤维比较浓密，比AE组稍致密，呈绺状垂直扎向种植体表面（图4E）。3个月时，S组结缔组织和种植体大部分开裂分离，胶原纤维致密排列，与种植体表面平行（图4F）；AE组胶原纤维排列较浓密，胶原纤维垂直扎向种植体表面（图4G）；ECE1组胶原纤维非常浓密，胶原纤维互相交错垂直扎向种植体表面，可见部分不规律斜行纤维（图4H）；ECE2组少量结缔组织与种植体分离，胶原纤维紧密排列呈绺状，垂直扎向种植体（图4I）；ECA组胶原纤维比较浓密，胶原纤维互相交错，垂直扎向种植体表面，可见不规律的斜行纤维（图4J）。生长3个月的结缔组织高度大于生长20d的结缔组织。

图2 20d时上皮组织与种植体表面结合部位扫描电镜图Fig.2 SEM pictures of conjunction of epithelium and implant surface at 20th day

图3 3个月时上皮组织与种植体表面结合部位扫描电镜图Fig.3 SEM pictures of conjunction of epithelium and implant surface at 3rd month

图4 20d和3个月时结缔组织和种植体表面结合部位扫描电镜图Fig.4 SEM pictures of conjunction of collagen fibers and implant surface at 20th day and 3rd month

2.3.3 种植体表面 20d和3个月时扫描电镜下 观察种植体表面均未见明显的上皮组织残留物。20d时，S组种植体表面较干净，见少量的膜状物和极少量胶原纤维残留，表面暴露大部分金属纹理（图5A和B）。AE组低倍镜下见表面残留胶原纤维量比光滑组多，呈斑片状；高倍镜下见胶原纤维与种植体表面垂直黏附（图5C和D）。ECE1组低倍镜下见种植体表面大部分被残留的胶原纤维覆盖；高倍镜下见断裂的胶原纤维垂直扎在种植体表面，部分胶原纤维平行于种植体（图5E和F）。ECE2组低倍镜下见种植体表面大部分被无定形基质和胶原纤维覆盖；高倍镜下见部分无定形基质与表面分离翘起，成簇的胶原纤维垂直扎向种植体表面（图5G和H）。ECA组低倍镜下见胶原纤维黏附于种植体表面呈簇状；高倍镜下见胶原纤维垂直黏附于种植体表面，部分无定形基质与表面分离翘起（图5I和J）。3个月时，S组低倍镜下观察种植体表面残留少量膜状物和胶原纤维，表面大部分暴露金属纹理，高倍镜下见残留的膜状物分离翘起，胶原纤维平行黏附在表面（图6A和B）。AE组表面残留的膜状物和胶原纤维比S组多，低倍镜下呈鱼鳞状，残留的胶原纤维厚实；高倍镜下发现胶原纤维垂直表面，其下面的无定形基质大部分与种植体表面分离（图6C和D）。ECE1组低倍镜下见表面凹孔中残留大量的膜状物和胶原纤维；高倍镜下见胶原纤维有水平平铺于种植体表面，也可见有垂直伸向种植体表面（图6E和F）。ECE2组低倍镜下见表面残留大量的胶原纤维，呈斑块状非常厚实；高倍镜下见胶原纤维伸出2～3个突起扎在凹孔中（图6G和H）。ECA组低倍镜下见残留大量的胶原纤维和膜状物，呈龟裂的斑块状；高倍镜下见胶原纤维垂直伸向种植体表面，像触角一样的突起紧紧抓在凹孔壁的纳米突上（图6I～K）。

图5 20d时去除软组织后种植体表面扫描电镜图Fig.5 SEM pictures of implant surface after removing soft tissue at 20th day

图6 3个月时去除软组织后种植体表面扫描电镜图Fig.6 SEM pictures of implant surface after removing soft tissue at 3rd month

2.3.4 与种植体表面黏附的软组织界面 20d和3个月时与种植体表面黏附的牙龈组织面无显著差别。S组与种植体黏附的牙龈组织面为光滑的一层无定形基质膜状结构（图7A）。AE组与种植体黏附的牙龈组织面见与种植体表面纳米突大小相对应的纳米凹（图7B）。ECE1组与种植体黏附的牙龈组织面见与种植体微米凹大小相对应且相对粗糙的微米突（图7C）。ECE2组与种植体黏附的牙龈组织面见与种植体表面微米凹大小相对应的光滑突起，该突起头大带蒂镶嵌在种植体表面（图7D）。ECA组与种植体黏附的牙龈组织面见与种植体微米－纳米结构大小相对应的微米突，该突起表面有大量纳米凹，与种植体表面形成错综复杂的微米－纳米镶嵌结构（图7E）。

图7 牙龈软组织与种植体结合部位的组织面扫描电镜图Fig.7 SEM pictures of tissue surfaces of gingival conjuncted with implant surface

3 讨 论

种植修复是否成功与骨和软组织对种植体表面的紧密附着有关，除了骨，软组织黏附于种植体颈部的封闭作用也是非常重要的[8]。种植体通过不同表面改性方法得到的不同粗糙表面可对成纤维细胞和胶原纤维产生较大影响[9]。近年来，对粗化种植体颈部表面形貌，尤其是微米形貌和纳米形貌的作用越来越受到关注[10]。

本组动物实验中有2只种植体可能因进食或咬硬物等不确定因素导致脱落，其余种植体均与周围组织结合良好。本研究观察到：S组胶原纤维平行黏附于种植体表面，结缔组织与种植体界面之间见较多大小不等的裂隙，撕脱软组织后的种植体表面残留的胶原纤维非常少，可见结缔组织与光滑表面种植体的黏附力是较低的。本研究结果表明：改变种植体颈部的表面形貌是提高软组织黏附的关键因素，尤其是多空三维的微米－纳米形貌，可诱导成纤维细胞呈锚状紧密扎在种植体表面空隙中，使结缔组织紧密附着，改善软组织黏附力[11]。本实验通过电化学方法得到的具有微米凹的ECE2表面，胶原纤维垂直扎入微米凹中，开裂现象少见；结缔组织与种植体结合的组织面形成头大带蒂的突起，该突起镶嵌在种植体表面微米凹中，在撕脱软组织这种强大的外力下，胶原纤维即使自身断裂，而胶原纤维根方像触手一样紧紧抓在微米凹壁上，特别是结缔组织生长3个月时的种植体表面，几乎全部被残留的胶原纤维覆盖，足以看出这种微米表面与结缔组织的黏附是很牢固的；ECA组结缔组织未见与种植体表面开裂，结缔组织组织面与种植体表面也形成了错综复杂的微米－纳米镶嵌结构，胶原纤维根方像触手一样垂直抓在微米凹和纳米突上，有的一根胶原纤维甚至分出2～3个分支抓在纳米突上，生长20d和3个月的种植体表面，均大部分被残留的胶原纤维覆盖，表明微米－纳米表面与结缔组织的黏附也非常紧密。Zhao等[12]研究发现：种植体表面大小适宜的空洞可以诱导结缔组织胶原纤维垂直插入种植体表面，形成紧密结合，表明以上的微米表面和微米－纳米表面均可促进结缔组织紧密附着，ECA组兼具的纳米表面更有优势。本研究中，AE组也可见结缔组织与种植体表面开裂，垂直伸向种植体表面的胶原纤维只能抓在纳米突上，结缔组织组织面与种植体表面的纳米级突起黏附，撕脱软组织后的种植体表面残留的胶原纤维不多，表明结缔组织与种植体黏附力不及ECE2组和ECA组，但优于S组；ECE1组种植体表面的微米凹为30～80μm，比ECE2组和ECA组的凹孔大，可见其表面有一部分胶原纤维平行黏附在种植体表面，而其他各实验组均未见任何平行黏附的纤维。有研究[13]发现：胶原纤维平行排列的结缔组织易向根方迁移，而垂直黏附的胶原纤维与种植体表面结合紧密，可防止其软组织退缩。本研究中，ECE1组种植体表面残留的胶原纤维较S组和AE组多，可推断该表面结缔组织的黏附力相对ECE2组和ECA组较弱，但优于AE组和S组。以上实验结果与Rossi等[14]研究结果相一致，与光滑种植体表面相比，粗糙多孔的微米－纳米种植体表面确实与上皮组织和结缔组织结合较紧密，软组织不易脱离，炎症反应轻且骨组织吸收少。本研究结果提示：种植体周围牙龈上皮和结缔组织的附着与种植体颈部的表面形貌密切相关，微米和微米－纳米 表面可促进结缔组织牢固附着，明显改善牙龈组织与种植体颈部的黏附，从而阻止结合上皮的根方移动，防止细菌及产物进入骨组织内，为种植的成功奠定基础。目前种植体表面影响软组织附着的微形貌大小形态研究结果不一，最适软组织黏附的精准表面和具体机制还有待于进一步探讨。

本研究虽发现上皮组织呈层状黏附于种植体颈部，但将种植体与牙龈撕脱后，种植体表面未见任何残留的上皮结构，可见上皮与种植体表面的黏附是非常脆弱的。本研究中，除S组外，结缔组织胶原纤维均垂直呈网状紧密黏附在种植体表面，撕脱牙龈后的种植体表面可见胶原纤维残留，这与Nevins等[15]研究结果一致，说明牙龈组织主要是依靠结缔组织黏附在种植体颈部，上皮组织的黏附作用非常微弱，结缔组织是封闭口腔环境和种植体－骨组织界面的重要结构。本研究结果显示：生长3个月时牙龈上皮和结缔组织厚度均明显大于生长20d的上皮和结缔组织，可见软组织生长成熟需要较长时间；同时发现：胶原纤维近种植体表面的一端埋在种植体表面的一层无定形物质中，厚约20nm，将种植体表面与胶原纤维分隔开，特别是ECE2组和ECA组，撕脱掉软组织后的种植体表面几乎看不到金属表面，只见与种植体表面形貌起伏相当的无定形膜状结构和残留的胶原纤维，结缔组织似乎是黏附在种植体表面，这种黏附可能有阻挡结合上皮根方迁移的作用。

[1]Diz P，Scully C，Sanz M.Dental implants in the medically compromised patient[J].J Dent，2013，41（3）：195-206.

[2]Quaranta A， Piattelli A， Scarano A， et al. Light microscopic evaluation of the dimensions of peri-implant mucosa around immediately loaded and submerged titanium implants in monkeys [J].J Periodontol，2008，79（9）： 1697-1703.

[3]Kokubu E，Hamilton DW，Inoue T，et al.Modulation of human gingival fibroblast adhesion，morphology，tyrosine phosphorylation，and ERK 1/2localization on polished，grooved and SLA substratum topographies [J].J Biomed Mater Res A，2009，91（3）：663-670.

[4]Yamano S，Ma AK，Shanti RM，et al.The influence of different implant materials on human gingival fibroblast morphology，proliferation，and gene expression [J].Int J Oral Maxillofac Implants，2010，26（6）：1247-1255.

[5]BaltriukienéD，Sabaliauskas V，Balĉiūnas E，et al.The effect of laser-treated titanium surface on human gingival fibroblast behavior [J].J Biomed Mater Res A，2013，10（1）：1-8.

[6]Kearns VR，Williams RL， Mirvakily F，et al.Guided gingival fibroblast attachment to titanium surfaces：aninvitrostudy [J].J Clini Periodontol，2013，40（1）：99-108.

[7]Schwartz‐Filho HO，Morandini ACF，Ramos Junior ES，et al.Titanium surfaces with nanotopography modulate cytokine production in cultured human gingival fibroblasts[J].J Biomed Mater Res A，2012，100（10）：2629-2636.

[8]Chai WL，Moharamzadeh K，Noort R，et al.Contour analysis of an implant-soft tissue interface [J].J Periodontal Res，2013，48（5）：663-670.

[9]Kim H，Murakami H，Chehroudi B，et al.Effects of surface topography on the connective tissue attachment to subcutaneous implants [J].Int J Oral Maxillofac Implants，2006，21（3）：354-365.

[10]Luigi G，Adriana O，Assunta BM，et al.Human gingival fibroblast functions are stimulated by oxidized nano-structured titanium surfaces [J].J Dent，2013，41（10）：71-90.

[11]Werner S，Huck O，Frisch B，et al. The effect of microstructured surfaces and laminin-derived peptide coatings on soft tissue interactions with titanium dental implants [J].Biomaterials，2009，30（12）：2291-2301.

[12]Zhao BH，Cui FZ，Liu Y，et al.Histomorphometrical and clinical study of connective tissue around titanium dental implants with porous surfaces in a canine model [J].J Biomater Appl，2013，27（6）：685-693.

[13]Furuhashi A，Ayukawa Y，Atsuta I，et al.Influence of Titanium Surface Topography on Peri-Implant Soft Tissue Integration [J].Key Eng Mater，2013，29（529）：559-564.

[14]Rossi S，Tirri T，Paldan H，et al.Periimplant tissue response to TiO2surface modified implants [J].Clin Oral Implants Res，2008，19（4）：348-355.

[15]Nevins M，Kim DM，Jun SH，et al.Histologic evidence of a connective tissue attachment to laser microgrooved abutments：a canine study [J].Inter J Periodontics Restorative Dent，2010，30（3）：245-255.