干旱胁迫对栓皮栎幼苗细根的生长与生理生化指标的影响

2014-09-19张文辉周建云韩文娟

生态学报 2014年15期

吴敏,张文辉,周建云,马闯,韩文娟

(西北农林科技大学西部环境与生态教育部重点实验室, 杨陵 712100)

全球气候变化与局部干旱化是干旱、半干旱地区植被恢复和造林成败的关键因素[1]。植物应对干旱胁迫的生理生化响应是植物生态学热点。其中土壤水分状况与植物细根关系的研究更是受到人们的重视。植物细根(直径≤2 mm)作为根系中生理功能最活跃的部分[2-3]，有着巨大的吸收表面积，是植物吸收水分和养分的主要器官[2]。当干旱来临时，细根最先感知，并迅速产生化学信号向上传递促使气孔关闭，以减少水分散失[4-5]。一部分研究表明干旱抑制根系的生长，包括抑制细根的扩展，加速细根的衰老，降低细根的寿命，最终将导致植物水分利用效率降低，如紫花苜蓿(MedicagosativaL)[6]、挪威云杉(Piceaabies)[7]、水曲柳(Fraxinusmandshurica)[8]；而另一部分研究则表明干旱可以促进根系生长，包括增加细根数量，表面积，会促使其积累更多的渗透调节物质，提高酶活性，从而提高植物水分利用效率，如橄榄(OleaeuropaeaL.)[9-10]、冬青栎(QuercusilexL.)[11]、柔毛栎(QuercuspubescensWilld)[12]。

其实植物根系的细根可以按照不同直径，划分成若干等级，不同等级的细根对干旱的敏感性均存在差异[12]。分析不同等级细根及其生理生化指标对干旱胁迫的响应，可能对评价植物干旱的耐受性更有意义[2,12]。然而，细根的生长发育主要发生在地下，目前对其认识和理解还远不能满足生产和实践的需求。因此，通过控制实验，研究植物不同等级细根生长及生理生化指标对干旱胁迫的响应，对阐明植物对干旱的适应机制和适应能力具有重要意义。

栓皮栎(QuercusvariabilisBl.)是重要珍贵用材树种和软木、栲胶资源树种。分布跨越22个省区(22°—42°N, 99°—122°E)是我国华北、西北、华南、西南地区主要成林树种，也是黄土高原半干旱区，落叶阔叶林的建群种，在当地涵养水源、保持水土和维持生态平衡方面发挥着巨大作用[13]。栓皮栎林受人为破坏严重，不少地区的天然林已沦为残败次生萌生林，矮林化现象明显，生态和经济效益降低，稳定性受到破坏[14]。通过营林措施，促进高品质林木结实和实生幼苗发育是改善林分品质的根本途径[15]。野外实地调查发现，尽管渭北黄土高原半干旱区的栓皮栎林结实量大，但实生幼苗数量稀少[13-14]。前期研究发现：种子发育成幼苗是栓皮栎生活史中最脆弱阶段，死亡率高，定居率低[16]。干旱可能是限制栓皮栎幼苗长发育和定居关键因素，但是目前就栓皮栎幼苗对干旱环境适应能力及适应机制的研究还十分缺乏[17]。而栓皮栎实生苗是否可以通过影响细根生长发育过程及其生理生化反应去适应干旱生境？此类研究还未见报道。这可能是从根本上阐明栓皮栎实生幼苗适应干旱机理的重要方面。

本文用盆栽方法人工模拟土壤干旱条件，设置对照、轻度、中度和重度4个水平的干旱处理，经历120天持续胁迫，测定不同干旱胁迫强度下当年生栓皮栎幼苗小细根(0.0

1 材料与方法

1.1 试验材料

2010年10月初在黄土高原的延安市黄龙县东南部的白马滩林场采用了优势树木对比法[19]，在保护较好的天然林生态系统和散生木中选取优良母树，分别标记、采种，带回。并选择大小相近、健康饱满的种子(坚果)沙藏(4℃)备用。试验所用的土壤为混和土，即采种地土壤(褐土)∶河床细沙∶腐殖质的土，按照体积分数1∶2∶1比例混合。土壤基本理化性质：田间最大持水量34%，pH值为 7.42，容重1.03 g/cm3，土壤有机质、全氮、全磷和全钾含量分别为 46.89、1.48、0.82 g/kg和28.47 g/kg。土壤经过烘干(80℃)到恒重，每盆均装入等量过筛的混合土12.4 kg。栽培容器选用上口径32cm，下口径23cm，高28cm的塑料花盆。试验在陕西杨陵西北农林科技大学苗圃温室大棚中进行(34°16′ 56.24″ N, 108°4′ 27.95″ E)，试验期棚内昼夜温度分别为25和14℃，光强为800 μmol·m-2·s-1，相对湿度保持在(65±5)%。于2011年3月开始播种育苗，每盆播沙藏后的种子5粒，共10盆；2011年4月待幼苗出现2—3片真叶，平均高度达6 cm时间苗，每盆留健壮幼苗1株，共40株；为保证幼苗健康生长，育苗期间供水量维持在田间持水量的80%。

1.2 试验设计

2011年5月18日待幼苗生长至5 — 6片叶子，株高(15.4±0.13)cm时，开始停止浇水10d(2011年5月28日)左右，待各盆土壤水分通过蒸发下降至预设的4个水分梯度，开始干旱胁迫试验。试验设置4个水分处理为：(1)正常供水，田间持水量的80%(CK)；(2)轻度干旱，田间持水量的60%(LD)；(3)中度干旱，田间持水量的40%(MD)；(4)重度干旱，田间持水量的20%(SD)；与其对应盆内土的实际含水量分别维持在(28.2±1.9)%、(21.1±0.6)%、(14.6±1.2)%和(6.8±0.7)%。每个处理10盆。采用称重法控制土壤水分含量，隔天浇水1次，每次浇水时间从18:00开始。所有盆土表面覆盖3—4cm厚的石英砂以降低水分蒸发。

2011年9月28日(胁迫120d)待栓皮栎幼苗生长速度减缓时，停止干旱胁迫，采取收获法取样。将每个处理的10株幼苗根系连同土壤从桶中取出，小心去除根系表面的大块泥土，迅速装入塑料袋中，保存在装有冰块的塑料桶内，带回实验室。将根系与地上部分分离，置于2—4℃冰水(去离子水)中小心洗净；将每个处理的其中7株幼苗的根系保存于超低温冰箱中(-80℃)，用于细根生理生化指标测定；另外3株用于细根形态指标、干物质量和相对含水率的测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 形态、相对含水率和干物质量的测定

(1)形态指标测定每个处理的幼苗洗净的完整根系先用扫描仪EPSON V7000(Epson company，Japan)扫描成图片，再将图片导入专业的根系分析软件Win-RHIZO Pro 2007a (Regent Instruments，Canada)进行分析。依据根系分析软件的结果，直径(D)≤2.0mm的细根被划分为2个等级, 0.0

(2)相对含水率测定先分别测定大小细根鲜重，再将其置于4℃完全黑暗的环境中吸水24h后测量饱和重，最后置于80℃烘箱中48 h后测得干重；计算相对含水率(%)=[(鲜重-干重)/(饱和重-干重)] × 100。

(3)干物质量的测定将幼苗所有大小细根，在80℃下烘至衡重(48h)，分别称得大小细根干重。

1.3.2 生理生化指标测定

测定各处理超低温冰箱中冷藏的幼苗的大小细根活力，采用TTC染色法[21]；丙二醛(MDA)含量测定，采用硫代巴比妥酸法[21]；游离脯氨酸含量测定，采用酸性茚三酮显色法[21]；可溶性糖含量测定，采用蒽酮法[21]；可溶性蛋白测定，采用考马斯亮蓝G-250染色法[21]；超氧化物歧化酶(SOD)活性测定，采用氮蓝四唑法，以抑制氮蓝四唑光氧化还原50%时的酶量为1个活力单位(U)[21]；过氧化氢酶(CAT)活性测定，采用紫外吸收法测定，以每分钟内引起OD240变化0.01的酶量为1个活力单位(U)[21]；过氧化物酶(POD)活性测定，采用愈创木酚氧化法，以每分钟内引起OD470变化0.01的酶量为1个活力单位(U)[21]；抗坏血酸过氧化物酶(APX)测定，以每分钟内引起OD290变化0.01的酶量为1个活力单位(U)[22]。测量仪器使用UV-1700(Shimadzu, Japan)型分光光度计，每个指标3个重复取其平均值。

1.4 数据统计与分析

采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)方法，分析干旱胁迫处理强度、直径等级以及二者的交互作用对栓皮栎细根的生长和生理生化特征的影响。分别对大小细根的生长和生理生化参数采用单因素方差分析(One-way ANOVA)比较不同干旱胁迫处理强度之间的差异性，平均数之间的多重比较采用LSD(Least significant difference)检验。所有数据统计使用SPSS 16.0统计软件进行。图形处理使用Origin7.5。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下栓皮栎幼苗细根形态、相对含水率和干物质量的变化

不同干旱胁迫下栓皮栎幼苗小细根(0.0对照>中度>重度胁迫处理(图1)。分别对比各干旱组与对照组的小细根形态参数发现：轻度干旱胁迫下只有小细根数量显著增加了6.51%(P<0.05)；中度和重度胁迫均抑制了小细根数量、长度、表面积及体积的增加，且在重度胁迫下小细根的数量、长度、表面积及体积较对照分别显著减少了22.73%、27.86%、35.52%和50.00%。而分别对比各干旱组与对照组的大细根形态参数发现：轻度胁迫下只有大细根的长度和体积分别显著增加了24.85%和26.32%(P<0.05)；而在中度和重度胁迫下大细根的数量、长度、表面积及体积均比对照组减少，但减少的差异均不显著(P>0.05)。进一步对比大小细根的形态变化发现(图1)：在各干旱处理下小细根的数量和长度均大于大细根，而大细根的表面积和体积大于小细根。此外，干旱处理和直径等级的交互作用对细根长度(P=0.232)与表面积(P=0.962)均无显著的影响(表1)。

图1 不同干旱胁迫下栓皮栎幼苗细根形态、相对含水率和干物质量的变化

表1 栓皮栎幼苗细根形态、相对含水率和干物质量的双因素方差分析

***表示极显著差异(P<0.001)；**表示极显著差异(P<0.01)；* 表示显著差异(P<0.05)；ns无显著相差异(P>0.05)

干旱胁迫极显著的降低大小细根的相对含水率：对照>轻度>中度>重度干旱胁迫处理(图1，P<0.001)。在各干旱处理下均是大细根相对含水率高于小细根(图1)。而干旱处理、直径等级及二者的交互作用分别对细根相对含水率产生极显著影响(表1，P<0.001，P<0.01)。

轻度胁迫下大小细根干物质量分别较对照增加了13.08%和10.66%，而中度和重度胁迫均限制大小细根干物质量的增加，且重度胁迫抑制作用更明显(图1)。此外，干旱处理、直径等级均对细根干物质量产生极显著影响(P<0.001)；二者的交互作用也对其产生显著影响(表1，P<0.05)。

2.2 干旱胁迫下栓皮栎幼苗细根丙二醛(MDA)含量的变化

本试验中用MDA含量来衡量细根脂质过氧化程度(图2)。干旱胁迫引起大小细根MDA含量极显著增加(P<0.001)。与对照相比，轻度、中度、重度处理的小细根MDA的含量分别增加了60.34%、71.41%和77.44%；轻度、中度、重度处理的大细根MDA的含量分别增加了59.85%、68.80%和76.47%。虽然不同直径等级的细根对MDA含量影响并不显著(表2，P=0.222)，但各处理下均是小细根中MDA含量高于大细根(图2)。此外，干旱处理与直径等级的交互作用对MDA含量的影响也不显著(表2，P=0.958)。

图2 不同干旱胁迫下栓皮栎幼苗细根丙二醛含量和活力变化

2.3 干旱胁迫下栓皮栎幼苗细根活力的变化

大小细根活力均随干旱强度的增加而极显著下降(图2，P<0.001)。与对照相比，轻度、中度、重度处理的小细根活力分别降低了27.48%、59.74%和65.01%；而轻度、中度、重度处理的大细根活力较对照分别降低了18.63%、50.99%和60.86%。对比各干旱处理下的大小细根活力，均是大细根活力显著高于小细根活力(表2，图2)，而干旱处理及直径等级的交互作用对细根活力产生极显著的影响(表2，P<0.001)。

2.4 干旱胁迫下栓皮栎幼苗细根渗透调节物质的变化

干旱胁迫引起大小细根游离脯氨酸含量极显著增加(图3，P<0.001)。与对照相比，轻度、中度和重度处理的小细根游离脯氨酸含量分别增加了33.11%、15.83%和9.01%；大细根游离脯氨酸含量分别增加了33.32%、22.31%和12.43%。各干旱处理下均是大细根游离脯氨酸含量显著高于小细根(表2，图3)。但干旱处理与直径等级的交互作用对其影响并不显著(表2，P=0.870)。

干旱胁迫也引起大小细根中可溶性糖含量极显著增加(图3，P<0.01)：中度>轻度>重度>对照处理。各干旱处理下均是大细根中可溶性糖含量高于小细根(图3)。但不同直径等级的细根对可溶性糖含量的影响并不显著(表2，P=0.078)，干旱处理与细根直径等级的交互作用也对其影响并不显著(表2，P=0.910)。

干旱胁迫下大小细根中可溶性蛋白含量的变化均是：轻度>中度>对照>重度干旱胁迫处理，但重度干旱与对照之间无显著差异(图3)。各干旱处理下均是大细根中可溶性蛋白含量高于小细根(图3)。而干旱处理、直径等级及其二者的交互作用均对细根中可溶性蛋白含量产生极显著的影响(表2，P<0.001，P<0.01)。

图3 不同干旱胁迫下栓皮栎幼苗细根游离脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量的变化

2.5 干旱胁迫下栓皮栎细根抗氧化酶活性的变化

SOD、CAT、 POD和APX为植物体内重要的抗氧化酶。干旱胁迫引起大小细根SOD活性显著增加(图4，P<0.05)，与对照相比，轻度、中度和重度处理的小细根SOD活性分别增加了29.45%、26.79%和12.381%，而大细根SOD活性分别增加了35.96%、29.25%和17.59%。干旱胁迫引起栓皮栎幼苗大小细根的CAT活性显著变化(图4，P<0.01)，与对照相比，重度处理导致大小细根CAT活性分别降低了15.85%和26.75%，而轻度和中度干旱胁迫均引起大小细根CAT活性增加，且轻度胁迫下其活性增加更快。大小细根POD和APX活性的变化：轻度>对照>中度>重度干旱胁迫处理(图4)。各处理下均是大细根中抗氧化酶活性高于小细根(图4)。

图4 不同干旱胁迫下栓皮栎幼苗细根抗氧化酶活性的变化

表2栓皮栎幼苗细根活力、丙二醛、渗透调节物质及抗氧化酶的双因素方差分析

Table2Tow-wayANOVAofvigor,MDA,osmolytes,andantioxidantenzymesinQ.variabilisBl.seedlingsoffineroots

F-value细根活力Vigor of fine roots丙二醛MDA脯氨酸Proline可溶性糖Soluble sugars可溶性蛋白 Soluble protein超氧化物歧化酶SOD过氧化氢酶CAT过氧化物酶POD抗坏血酸过氧化酶APX处理Treatment81733.081∗∗∗60.519∗∗∗19.066∗∗∗10.308∗∗293.673∗∗∗36.774∗∗∗15.097∗∗∗30.755∗∗∗43.518∗∗∗直径等级Diameter class16440.084∗∗∗1.582ns11.328∗∗3.540ns42.028∗∗∗14.875∗∗0.603ns8.678∗∗2.375 ns处理×直径等级Treatment × diameter class1250.886∗∗∗0.101ns0.236ns0.178ns6.590∗∗1.042∗0.106 ns2.421ns0.650ns

ns无显著相差异(P>0.05)

处理、直径等级均对细根SOD活性产生极显著影响(P<0.001，P<0.01)，且二者之间也具有明显的交互作用(表2，P<0.05)。处理也均对细根CAT和APX活性产生极显著影响(P<0.001)，而直径等级以及处理和直径等级的交互作用则均未对CAT和APX活性产生显著影响(表2)。处理、直径等级均对POD活性产生极显著影响(P<0.001，P<0.01)，但二者之间并没有明显的交互作用(表2，P=0.104)。

3 讨论与结论

植物根系形态变化是生理生化变化的外在表象，而形态发生变化也必然会引起内在生理生化指标的变化，二者的变化是相辅相成共同作用抵抗逆境[23]。本研究发现：长期持续干旱胁迫除了使栓皮栎幼苗细根形态发生变化，其生理生化反应也了发生变化，具体表现在根细胞发生脂质过氧化、细根活力、渗透调节物质的积累以及抗氧化酶活性的变化，但其变化趋势并不总是一致的，且这些指标变化在不同直径等级细根间也存在差异。

大量研究表明：随着土壤水分含量的减少，植物生长中心必然向根系转移，使根系增长，并增加根表面积及其在土壤中所占的体积[5, 24]。而细根的数量、长度、表面积、体积可作为综合衡量根系质量的一个标准，这些指标的增加或下降，可用于反映苗木根系在干旱条件下吸水能力的增强或减弱[25]。本研究发现：干旱胁迫下的栓皮栎幼苗大小细根生长并非都表现为单一的被促进或抑制，而是与胁迫程度有关；轻度干旱对大小细根的数量、长度、表面积以及体积的增加具有促进作用，而中度和重度干旱则抑制了大小细根的生长。这一结论暗示：与其它胁迫梯度相比，轻度干旱可以促进栓皮栎根系的分枝，使得单位体积上细根数量增多、表面积增大对增加根系吸收能力极为有利，这也是栓皮栎降低水分消耗、避免和忍耐水分亏缺的适应策略。Cortina[26]也发现：乳香黄连木(PistacialentiscusL.)在受到适度的干旱胁迫时，会迅速扩展细根的长度及表面积，通过细根形态的塑造使其避免干旱环境的危害。

本研究观察到大小细根干物质量的积累均受干旱胁迫程度的影响，轻度干旱胁迫下细根的干物质量均比对照组提高，中度干旱下细根干物质量开始发生下降，而重度干旱则导致其干物质量更显著的降低。可能是中度和重度干旱降低了栓皮栎幼苗光合碳固定的能力，碳向根系分配减少，最终导致细根干物质积累量的降低。Ogbonnaya等[27]研究结果也证实：植物根的生长依赖于地上部分碳水化合物供应，在干旱环境下，由于光合产物积累下降而导致向根部供应的碳水化合物短缺，从而限制了根的干物质的累积。

植物在遭受干旱胁迫时，细胞膜发生过氧化作用而受到损伤，MDA 是脂质过氧化作用的产物之一，是检测膜损伤程度的公认指标[28]。根系活力直接影响植物对矿质营养和水分的吸收利用，从而对植物的生长发育起决定性作用[8]。本研究中，随干旱胁迫程度的加深，大小细根中 MDA 含量显著升高，同时大小细根活力呈显著下降，说明干旱使栓皮栎幼苗发生脂质过氧化，质膜遭到不同程度的损害，并导致其活力下，对细根吸水能力产生不同程度的负面影响。特别是重度胁迫下MDA含量增加最快，而活力下降最快，导致细根生长发育迅速减慢，如细根的数量、长度、干物质量等减少，表明重度胁迫严重影响了细根对矿质营养和水分的吸收能力，并导致植物代谢紊乱，其修复能力下降，如保护酶活性、可溶性蛋白含量下降，最终将导致细根发生衰老甚至死亡[8]。

干旱环境下植物也会通过主动积累渗透调节物质，如游离脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的大量积累，来提高细胞液浓度，从而维持细胞膨压，防止原生质过度脱水，为正常生命活动创造条件[29-30]。而且抗旱性越强，游离脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量越高[31]，但在重度胁迫下游离脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量可能下降[8, 32]。本研究显示：干旱胁迫下栓皮栎幼苗大小细根的游离脯氨酸和可溶性糖累积量总是高于对照组，表明干旱胁迫下栓皮栎幼苗的细根可以通过积累游离脯氨酸和可溶性糖来提高根系的吸水能力，增加细胞的渗透调节能力，从而在叶水势大幅度下降的同时降低渗透势[17]，维持幼苗正常生长所需的膨压，这是栓皮栎幼苗在干旱环境下的一种保护性反应。除渗透调节作用外，游离脯氨酸还具有防止蛋白质结构受到破坏以及稳定酶结构与活性的功能[31]。当栓皮栎幼苗细根受到轻度干旱胁迫时，积累了更多的游离脯氨酸，在很大程度上也保证了它们具有较高的抗氧化保护酶活性(SOD、CAT、 POD和APX)。Liu等[33]对我国西南部喀斯特地貌生境下的两种灌木和4种乔木的干旱研究也发现游离脯氨酸含量和SOD、CAT、 POD活性均存在显著正相关性，说明干旱胁迫下植物体内脯氨酸的积累有助于活化抗氧化酶系统。另外，本研究也显示：在重度干旱胁迫下，栓皮栎幼苗大小细根的可溶性蛋白含量减少。一方面可能是由于蛋白酶的活性升高，使其水解加快，降解后的蛋白形成了脯氨酸等其他具有调节功能的氨基酸；另一方面可能由于细胞体内积累大量活性氧，从而损伤了DNA的复制过程，使细胞蛋白质和核酸的合成能力减弱[34]。而卫星等[8]也认为细根内蛋白质合成能力减弱可能是造成干旱胁迫下蛋白质含量下降，细根活力减弱，发生衰老死亡的又一重要因素。

不同直径细根受土壤环境要素的响应程度存在差异，其差异性直接影响根系的固着和吸收功能[23]。研究栓皮栎小细根(0.0

综合分析表明，干旱胁迫强度对当年生栓皮栎幼苗大小细根的生长、干物质量的累积和生理生化反应均产生了显著的影响，且对小细根的影响更显著。轻度胁迫(土壤含水率(21.1 ± 0.6)%)总是促进大小细根的生长发育，提高了根系渗透调节和抗氧化能力；尽管在中度胁迫(土壤含水率(14.6±1.2)%)下细根可以保证较高的渗透调节作用，但其部分抗氧化酶系活性(如POD、APX)已经开始发生下降，最终也导致其生长、干物质量累积开始发生下降；而重度胁迫(土壤含水率(6.8±0.7)%)严重抑制了细根的生长、干物质量、可溶性蛋白含量及CAT、POD和APX的活性，导致其细根中MDA含量增加最快，活力下降最快。然而，在重度胁迫结束时，幼苗并未死亡，且大小细根可以通过积累游离脯氨酸和可溶性糖调节根细胞的吸水能力，使大小细根相对含水率分别不低于79%和67%。这说明栓皮栎当年生幼苗具有较强的干旱适应能力，适合应用在黄土高原等半干旱区退化生态系统植被恢复重建与造林工程中。因此，自然生境下栓皮栎幼苗数量少，天然更新缺乏不能简单的归因于干旱胁迫限制幼苗存活。应该充分考虑自然生境下生物与非生物环境的共同作用，如栓皮栎种子淀粉含量高受虫害、动物取食的影响较为严重，影响了土壤种子库的有效种子的输入；并且干旱是否会对栓皮栎种子萌发造成影响，进而影响幼苗更新，都还需要进一步在自然条件下展开系统的研究。

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