泡菜中乳酸菌的分离及其苯乳酸产量研究

刘长建，刘 秋，姜 波，闫建芳，齐小辉

(大连民族学院生命科学学院，辽宁大连 116605)

苯乳酸(PLA)又称3-苯基乳酸，或β-苯基乳酸即2-羟基-3-苯基丙酸。苯乳酸是继乳酸菌产生的第一代抑菌物质如乳酸、醋酸和第二代抑菌物质如乳链菌素、片球菌素等细菌素以外的第三代天然抑菌物质。能抑制有害微生物的生长和发育，抑制有害微生物产生毒素，有效抵抗细菌和病毒的感染，进而提高机体的免疫力，保持机体健康状态［1］。Dieuleveux发现，苯乳酸抑菌谱广，对G+细菌、G-细菌和真核微生物均有抑制作用，这与Nisin等细菌素显著不同。大部分细菌素只对与产生菌分类学上相近的细菌有作用，如Nisin抑制许多除乳酸菌以外的G+细菌，但对绝大部分G-细菌和酵母菌、霉菌没有作用［2］。乳酸菌的某些属种具有合成苯乳酸的能力，国外专利及文献中已报道从不同生物来源特别是发酵食品中分离得到合成苯乳酸的乳酸菌菌株，如Lactobacillus plantalum 等［1，3-4］。

本实验尝试从发酵食品泡菜中分离出能产生苯乳酸的乳酸菌株，使其在食品、医药、化工等领域发挥新的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

发酵食品泡菜购自大连市场。

1.2 仪器及试剂

主要仪器包括液相色谱仪(日本岛津);UV-2450分光光度计(日本岛津);DNP-9052恒温培养箱(上海精宏);TC-512基因扩增仪(Techne)等。PCR反应所用的相关试剂均购于大连宝生物。其他试剂均为天津科密欧分析纯产品。

1.3 培养基

分离用培养基:MRS培养基(Merck)和M17培养基(Oxoid)。

其他培养基:PY培养基、PYG培养基和含6.5%，18%NaCl的 MRS 培养基［5］;含苯丙氨酸(PPA)的液体培养基。

1.4 方法

1.4.1 乳酸菌的初步分离及纯化

取1.0 g样品加入9.0 mL无菌水室温浸泡24 h。连续稀释后取100 μL分别涂布于含碳酸钙的2种分离固体培养基，37℃静置培养24～48 h。挑取产生溶钙圈的单菌落，转接于对应的分离培养基中，37℃培养24 h，纯化2次。筛选过氧化氢酶阴性、革兰氏阳性、HPLC法检测产乳酸［6］的菌株进行下一步研究。

1.4.2 菌落形态、菌体细胞形态及生理生化特性

乳酸菌接种平板后，37℃恒温培养，48 h后记录菌落边缘形状、大小、颜色、与培养基的结合程度等菌落特征。同时高倍显微观察菌体革兰氏染色、个体形状、大小等细胞特征。分别测定菌株在10℃和45℃的生长情况、运动性、耐盐性等生理生化特征［5］。

1.4.3 菌株的分子生物学鉴定

将纯化得到的菌种在37℃条件培养2 d后，离心收集菌体，提取细菌总DNA。采用通用引物对其16S rDNA进行扩增，并进行测序后将序列输入NCBI核酸数据库中，与基因库内所有核酸序列进行系统发育分析［6］。

1.4.4 乳酸菌产苯乳酸试验

将菌株以2%的接种量分别接种于含0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、0.20%苯丙氨酸的MRS液体培养基，37℃静置培养48 h。将菌株按2%的接种量接入含最适浓度苯丙氨酸的MRS液体培养基，于37 ℃培养箱中分别静置培养 24，36，48，60，72 h。发酵液离心后取上清，0.2 μm的膜过滤，高效液相色谱测定苯乳酸的含量［1，6］。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的筛选分离

根据菌落形态共筛选出12株疑似乳酸菌，转接于对应的分离培养基中，纯化2次。筛选过氧化氢酶阴性、革兰氏阳性、发酵产乳酸［6］的、生长较好的2个菌株。

2.2 菌株的多相鉴定

2.2.1 菌落特征、细胞形态

2个菌株在MRS培养基上培养36 h后菌落均为乳白色，边缘光滑、圆整、粘稠，直径在0.3～0.5 mm。革兰氏染色呈阳性，细胞短杆状，细胞间呈短链或球状排列(如图1)。

图1 菌株细胞形态的显微观察(×100)

2.2.2 耐盐、耐温特征

乳酸菌LMD在10℃和45℃均不生长，而LRA2在10℃不能生长，但能耐受 45℃;在6.5%NaCl时2个菌株都能生长，而菌株LRA2在NaCl质量体积达到18%时不能生长(见表1)。

表1 菌株生长特性

2.2.3 16S rDNA序列分析

以菌株LMD、LRA2总的DNA为模板，扩增获得了2条特异的扩增条带，长度分别为1387 bp和1090 bp。将序列提交到GenBank获得登录号分别为KC108666和KC108667。通过Blast程序与GenBank核酸序列库中的序列进行比对，发现LMD和LRA2与多株肠膜明串珠菌的相似性都超过99%。明串珠菌属共13个种［7］的eztaxon网站的16S rRNA序列，与菌株LMD和LRA2进行聚类分析(如图2)，菌株 LMD和 LRA2与 Leuconostoc mesenteroides的3个亚种在同一分支上。因此可以确定菌株LMD和LRA2属于明串珠菌属中的肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)。图2中分支上的数值为自举1 000次的结果，当数值≥51%时显示。

图2 菌株LMD、LRA2和参比明串珠菌属菌株的16S rDNA同源性的系统发育树

2.3 乳酸菌产苯乳酸能力

乳酸菌LMD和LRA2皆能产苯乳酸，且产量随着培养基中PPA质量浓度上升而变大(如图3)。当培养基中PPA达到0.16%时，菌株的苯乳酸产量增加趋势变缓;当到达0.2%时，菌株LMD苯乳酸产量达0.132 2 mg·mL-1，菌株LRA2 产量达 0.124 5 mg·mL-1。

图3 培养基中苯丙氨酸含量对菌株产苯乳酸量的影响

当培养基中含0.16%PPA时，菌株的苯乳酸产量随时间增加而增加(如图4)。前48 h，菌株LMD和LRA2的苯乳酸产量增加缓慢;而在48～60 h，菌株LMD和LRA2的苯乳酸产量增加趋势最快。当培养72 h时，菌株产苯乳酸含量最高，LMD和LRA2的苯乳酸产量分别达0.144 7 mg·mL-1和 0.158 5 mg·mL-1。

图4 培养时间对菌株产苯乳酸量的影响

3 结论与讨论

乳酸菌在自然界分布广泛，实验从泡菜中初步分离得到过氧化氢酶阴性、革兰氏阳性、发酵液产乳酸的乳酸菌12株，通过温度、高盐试验筛选到2株乳酸菌LMD和LRA2。根据菌落、细胞形态、生理生化特性以及16S rDNA序列比对，可鉴定LMD和LRA2为肠膜明串珠菌。采取在培养基中添加苯丙氨酸的方法，利用HPLC法测定乳酸菌发酵液中苯乳酸的产量，菌株LMD和LRA2均能利用苯丙氨酸产苯乳酸。苯乳酸的产量与培养基中苯丙氨酸的添加量呈正相关;当苯丙氨酸的添加量为0.16%时，苯乳酸的产量与培养时间呈正比，在48～60 h产量增加最快;在72 h时，LMD的苯乳酸产量为0.144 7 mg·mL-1，LRA2的苯乳酸产量为0.158 5 mg·mL-1。

已经有 Lactobacillus、Weissella、Enterococcus、Leuconostoc等多个属的细菌能产苯乳酸的报道［1，3，4，8，9］，如李兴峰［1］等分离的 112 株乳酸菌中有70株的苯乳酸产量在0.0166～0.0914 mg·mL-1。但目前明串珠菌属的报道不多，只有Valerio［8］等从橄榄叶中分离的Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides ITMY30能产生0.094 6 mg·mL-1苯乳酸，低于本研究分离的Leuconostoc mesenteroides LMD和LRA2的苯乳酸产量。本研究和其他研究表明，苯乳酸可能是乳酸菌的普遍代谢产物，个体差异大，其产量取决于菌株个体［1，8］。目前看来短期内苯乳酸不能完全取代化学防腐剂和抗生素，但从长远观点看，随着科学技术的发展，本实验筛选出的高产苯乳酸菌株可作为菌株资源进行深入的研究。

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［6］刘长建，闫建芳，刘秋，等.猪消化道中产苯乳酸乳酸菌的益生特性研究［J］.微生物学通报，2012，39(6):804-810.

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