传统中药质量控制生物活性标志物的筛选方法综述

张慧仙

摘要：传统中药（TCMs）具有特有的理论基础和悠久历史的临床实践，使其在全世界获得了越来越多的关注。但是中药质量的不可控性成为限制其现代化和全球化发展的瓶颈。随着科学技术的发展和人们对中药质量控制研究的深入，一些新兴的分析方法被发现和运用。该文综述了中药中通过生物色谱法筛选生物活性标志物的策略来研究其质量控制的方法，这些方法具有高灵敏、定量准确等特点，对中药精准的质量控制具有重要意义。

关键词：中药；质量控制；生物活性标志物；筛选方法

中图分类号 R282 文献标识码A文章编号1007-7731（2014）13-19-02

1 前言

在中国，中药用来预防和治疗人类疾病已有数千年的历史。由于中药悠久历史的临床应用和可靠的治疗功效，其吸引了全球的关注，许多大的制药公司都将中药作为一个好的储存库来发现具有天然生物活性的化合物。然而，中药具有复杂的化学成分，倘若在研究时只强调少数的化学成分，那么其整体性将被忽略［1］。

在中药现代化和全球化的过程中，中药的关键问题是其质量的稳定性和可控性。一般地，中药的识别是通过其形态、TLC鉴别或者含量测定的几个标志物。然而，这些方法不能提供药物的所有性质，不能用来区分具有相似形态或者相似化学组成的中药，如无法用齐墩果酸来识别女贞子、牛膝或威灵仙的根。由于中药具有多靶点和协同作用的特性，所以有必要在天然药物中找到一种用来反映大多数成分变化的综合方法，尤其是与药理作用和临床疗效有关的变化。因此，近几年来，中药分析已经开始着重于分析中药的整体性和综合性。许多综合方法如指纹图谱—包括色谱法和光谱法、多组分分析法，已经用于中药质量控制；一些基于研究药物的吸收、分布、代谢和消除性能的生物色谱法也已经用于中药分析和生物活性标志物的筛选；同时还引入一些其他系统生物学方法（包括基因组学和蛋白质组学）来更清晰、科学地研究中药。

2 通过生物色谱法对生物活性标志物的筛选

目前，中草药质量控制的方法是化合物定位或全局定位，前者针对的是已知分子结构和化学性质的特定成分，而后者针对的是所有可检测的成分。在化合物定位实验中，选择一个与疗效有关的化学标志物是非常重要的。但是由于中草药中具有治疗性或活性的成分还没有被全部阐明，这些成分常被一些不具有特征性但是易获得的组分选择性替代，因此这些不恰当的标志物不能确保中药有效的质量控制。因此，中药生物活性成分的筛选不仅对阐明治疗物质基础和发现先导化合物有积极意义，而且对质量控制提供适合的化学标志物也有重要的作用。

传统的具有生物活性化学标志物的筛选方法是首先对化合物进行分离，然后运用动物模型、器官或组织模型、细胞模型或者酶和受体模型对其进行体内或者体外生物活性的筛选。然而，这些模型后来被证明既费时又费力，同时也不能恰当地阐明中药的协同作用。因此，人们将一些新的综合方法用于中药潜在活性成分的筛选和预测。一般来说，生化色谱法在生物活性物质筛选和分析方面有3个策略：第一，将某些生物分子固定在色谱柱上，来反映被分析物和色谱柱上靶点之间的亲和作用；第二，运用色谱指纹图谱分析中药与某些目标的生物大分子（DNA、蛋白质、细胞、酶等）的相互作用；第三，通过体内或体外的方式研究中药的代谢，然后分析代谢指纹图谱。

2.1 固定化亲和色谱法 亲和色谱法是根据生物活性化合物与固定化的靶标大分子（蛋白质、酶、抗体、脂质体、DNA等）之间的生物交互作用，该方法已被成功地应用到快速探测药物靶标结合，并研究蛋白质-配体结合的相互作用。这包括了固定化DNA层析、固定化血浆蛋白层析、固定化脂质体色谱（ILC）和固定化生物膜色谱（IBMC）。

DNA是用于筛选具有治疗性和毒性的潜在候选药物的重要指标之一。血浆蛋白在药物分布的过程中具有重要的作用，因此2个主要的血浆蛋白、人血清白蛋白（HSA）和α1-酸性糖蛋白（AGP）通常用于候选药物的筛选。与前2种方法不同，ILC与IBMC对于体外研究药物-生物膜相互作用来说是好的模型，它可以通过生物膜探测药物的渗透能力。运用这些方法，可以对很多中药材或它们配伍的处方进行了研究，包括川芎、黄连、大黄、当归、龙胆泻肝汤（LXD）及当归补血汤（DBD）等［2-3］。

虽然这些方法已被批准用于从中药中快速筛选和分析生物活性候选物的方法，但是应注意到其有一定的局限性。如只有一种类型的靶点被固定在固定相上（例如只有HAS），那么与其它靶点结合的活性化合物可能会丢失；固定化靶点的寿命是非常短的，并且所分析的物质和所用的凝胶基质必须适应于包封或固定化过程；亲和色谱法的分离能力要低于传统的HPLC法，以至于几个化合物可能被共洗脱出来成为一个峰，并且由于流动相的限制，这种方法不能直接和MS联用，导致保留组分联机识别具有一定的难度。

2.2 生物指纹图谱分析法 为了克服通过亲和色谱法筛选方法时存在的问题，邹和李课题组提出中药的多生物活性化合物筛选和分析的一些方法，这些方法是基于中药提取物与生物系统（DNA、蛋白质、细胞等）相互作用前后指纹图谱的变化［4-5］。HPLC和HPLC-MS是常用的分析方法，根据不同的取样方法，这些生物指纹图谱分析被分为3种类型，即微透析提取法、平衡透析提取法和细胞或靶分子提取法。

微透析和平衡透析的机制非常相似，因为它们都使用了半透膜原理来区分中药中与靶分子已结合的成分和未结合的成分［4］。平衡透析中，脂质体平衡透析（LED）是一种成熟的技术用于中药中交互式成分的筛选。通过这种方法，当归补血汤（DBD）中15种渗透组分通过联机LC-MS可以同时预测和确定，其中8种成分已经被报道是当归中主要的生物活性成分。与平衡透析相比，微透析结合HPLC和HPLC-MS已被更广泛地应用于研究中药与各种靶标（如DNA、HAS、微管、乳腺癌细胞MCF-7等）的相互作用。

细胞或靶分子的提取是基于假设中药中潜在活性成分选择性地结合靶细胞或者一些靶分子，因此，在悬浮液介质中的细胞或靶分子结合组分的相对浓度应降低，同时在变性细胞的提取物中细胞或靶分子结合组分也可检测到［4］。基于上述提出的方法，冬虫夏草中潜在的活性成分与当归补血汤、少腹逐瘀汤等配方相结合，通过不同的细胞株（如内皮细胞株，Caco-2细胞株（结肠癌细胞株），巨噬细胞株，HL-7702细胞株（人肝细胞株），RAW264.7细胞株（小鼠单核巨噬细胞株）等）提取进行了研究［5］。

由于中药的复杂性，中药中每一个化合物都进行纯化是不切实际的，因此，上述文库筛选是非常有意义的。除了已知活性的成分，一些未知的潜在活性成分通过这种方法也可以被检测到。另外，这些方法可以同时捕捉到许多潜在的生物活性成分，可以更好地反映中药的协同效应和拮抗效应。例如，运用微透析法或者HPLC法可以测得来自于黄连和黄柏中具有相似浓度的黄连素（分别为0.014和0.015mM）与DNA有不同的亲和力（分别为48.2%和29.1%）。这些结果表明存在于提取物中的其他化学成分与检测到的化合物可能具有协同作用或者拮抗作用。这些方法的另外一个优点是运用HPLC-DAD（ELSD）或者LC-MS技术联用不仅提供更的高分辨率而且提供联机结构鉴定。然而，在进行分析时，该方法的局限性应该被考虑，第一，不是每一个模型都适合于所有的中药，比如，苦参在DNA模型中没有发现任何一种潜在活性成分；第二，不同的筛选方法的平行度不是很好，所以很容易造成混乱，这可能与中药多靶点多通道的性质有关，例如，DBD的活性成分在不同的筛选方法是不同［5］。就整体而言，这些生物指纹图谱分析提供了强大且快速的方法来筛选中药的生物活性标记物，而且其也展现出对研究中药与更复杂的生物系统相互作用的光明未来。

2.3 代谢指纹图谱法 自从引入血清药理学和血清药物化学筛选生物活性成分，这种方法已经广泛用于阐明中药的治疗基础和作用机制，通过对比中药的化学性质和其代谢物性质。张运用HPLC-UV和HPLC-MS分析了丹参注射液的化学指纹图谱和代谢指纹图谱，确定了多酚酸是主要的治疗物质，同时建议结合化学指纹图谱和代谢指纹图谱对该产品建立一个强大的质量控制模型。除了对体内代谢物研究之外，还建立了一些体外代谢物模型，比如肝组织匀浆和肠细菌匀浆。

3 结论

亲和色谱法、生物指纹图谱和代谢指纹图谱的方法为筛选中药中潜在的活性化合物提供了新技术和新方法，这些方法可以帮助我们发现中药中潜在的活性成分。

参考文献

［1］Xie PS，Leung AY.Understanding the traditional aspect of Chinese medicine in order to achieve meaningful quality control of Chinese materia medica［J］.J.Chromatogr.A，2009，1 216（11）：1 933-1940.

［2］Su X，Hu L，Kong L，Lei X，et al.Affinity chromatography with immobilized DNA stationary phase for biological fingerprinting analysis of traditional Chinese medicines［J］.J Chromatogr A，2007，1 154（1-2）：132-137.

［3］Wang Y，Kong L，Lei X，Hu L，et al.Comprehensive two-dimensional high-performance liquid chromatography system with immobilized liposome chromatography column and reversed-phase column for separation of complex traditional Chinese medicine Longdan Xiegan Decoction［J］.J Chromatogr A，2009，1 216（11）：2 185-2 191.

［4］Lei X，Kong L，Zou H，et al.Evaluation of the interaction of bioactive compounds in Cortex Pseudolarix and Radix Stephaniae by the microdialysis probe coupled with high performance liquid chromatography-mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2009，1 216（11）：2 179-2 184.

［5］Zhang X，Qi LW，Yi L，et al.Screening and identification of potential bioactive components in a combined prescription of Danggui Buxue decoction using cell extraction coupled with high performance liquid chromatography［J］.Biomed Chromatogr，2008，22（2）：157-163. （责编：张宏民）