芦丁对大鼠缺血再灌注心肌组织iNOS和eNOS mRNA表达的影响*

钱国强 丁晶晶 尹晓峰 李 茹 赵国平

1黄淮学院护理学系，河南驻马店 463000 2暨南大学医学院，广州 510632

研究[1]表明，多酚类化合物，包括黄酮类和酚酸具有抗氧化、降糖和抗高血压等多种功能。自从类黄酮被证明能降低慢性疾病的风险后，近期研究便集中在其对心血管疾病相关炎症的预防上[2]。芦丁(RT)是主要的黄酮类化合物之一，也被称为维生素P，具有抗血小板、抗病毒、抗高血压、自由基清除活性和抗氧化能力[3]。最新研究[4]发现，芦丁对缺血再灌注损伤有干预作用。由于缺血预处理(ischemic preconditioning，IP)可明显减轻随后的缺血再灌注损伤，其机制可能与促进内皮型一氧化氮合酶(eNOS)诱导的一氧化氮(NO)合成有关。因此，本文建立SD大鼠心肌缺血再灌注模型，探讨芦丁缺血预处理对大鼠心肌的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠32只，体质量250～300 g，购自广东省实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2008-0002。

1.2 试剂及器材

芦丁注射液和L-NAME(Sigma公司)，NO检测ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)，CK-MB测定试剂盒(北京华宇亿康生物工程技术有限公司)。全自动生化分析仪(7020，日立)，动物呼吸机(ALC-V，上海奥尔科特生物科技有限公司)，全波长荧光扫描酶标仪(Safire 2，北京东胜创新生物科技有限公司)，心电图机(ASB240V，生物机能实验系统，成都遨生电子有限公司)，PCR仪(CFD-3120，Bio-Rad)。

1.3 心肌缺血再灌注动物模型建立

SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉(40 mg/kg体质量)，固定后行气管切开，气管插管，连接呼吸机并给予机械通气，通气量为5 ml/100 g体质量；呼吸频率为60～80次/min，呼吸比为2：1，予呼气末持续正压呼吸，于胸骨左缘2～4肋间打开胸腔及心包膜，暴露心脏；在肺动脉圆锥右缘、平左心耳下缘1～2 mm处，经左冠状动脉下浅层心肌穿5/0号丝线，结扎，模型复制的可靠性用连续监视ECGⅡ导联的变化来判断，以ST段抬高为心肌缺血存在，以ST段回落1/2为再灌注成功。

1.4 实验分组

32只大鼠随机分为对照组、模型组、芦丁组和L-NAME组，每组8只。对照组未经缺血再灌注处理；模型组SD大鼠心肌缺血30 min再灌注120 min后取材；芦丁组于实验前30 min按50 mg/kg股静脉注射芦丁注射液，再灌注120 min后取材；L-NAME组于实验前30 min按50 mg/kg股静脉注射芦丁注射液，并于再灌注前15 min按30 mg/kg股静脉给予L-NAME，再灌注120 min后取材。

1.5 血清NO水平和CK-MB浓度检测

腹主动脉取血后静置30 min，4 ℃离心15 min，取血清均按照试剂盒说明检测。

1.6 eNOS和iNOS mRNA表达的测定

采用实时荧光定量PCR法测定eNOS和iNOS mRNA的含量，以GAPDH为内参，GAPDH引物为：上游5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′和下游5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′；eNOS引物为：上游5′-CGA GAT ATC TTC AGT CCC AAG C-3′和下游5′-GTG GAT TTG CTG CTC TCT AGG-3′；iNOS引物设计为：上游5′-TCT GTG CCT TTG CTG ATG AC-3′和下游5′-CAT GGT GAA CAC GTT CTT GG-3′。RNA抽提按照试剂盒说明进行，测纯度OD260 /290在1.9～2.1之间良好，按照试剂盒说明书将反应设为50 μl体系，95 ℃变性2 min，40循环扩增(95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 30 s)，完成实验后数据采用2-ΔΔct分析。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠血清NO、CK-MB水平

与对照组比较，模型组血清NO水平明显降低，CK-MB水平明显升高(P<0.01)；与模型组比较，芦丁组血清NO水平明显升高，CK-MB水平明显降低(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠血清NO、CK-MB水平的比较(n=8，±s)

与对照组比较*P<0.01；与模型组比较△P<0.01

2.2 各组大鼠心肌组织eNOS和iNOS mRNA的表达

与对照组比较，模型组心肌组织eNOS mRNA表达明显降低，iNOS mRNA表达明显升高(P<0.01)；与模型组比较，芦丁组心肌组织eNOS mRNA表达明显升高，iNOS mRNA表达明显明显降低(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠心肌组织eNOS和iNOS mRNA的比较(n=8，2-ΔΔct，±s)

与对照组比较*P<0.01；与模型组比较△P<0.01

3 讨论

1987年Palmer等[5]发现NO就是内皮源性舒张因子(endothelium-derived relaxing factor，EDRF)，目前研究认为在基础状态下血管内皮细胞的NO释放对维持心血管系统处于恒定的舒张活性状态，调节血压，调节冠状动脉基础张力和心肌血流灌注有重要作用。NO使血小板中cGMP水平升高，导致细胞质游离钙进入亚细胞器而使其浓度降低，从而抑制其聚集黏附[6]。在血管内皮细胞、平滑肌细胞及粒细胞中均有NO存在，在炎症时NO过量产生可以使血管通透性增加，炎性细胞浸润、蛋白渗出加剧。有研究[5]提示心肌缺血再灌注后NO生成受损，应用NO前体L-精氨酸可增加NO产生，具有保护作用。此外，证实NO对缺血再灌注有保护作用[7]，但是，一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制剂L-NAME减少了NO的生成，并未加重损伤[8]；也有部分研究[9]表明减少NO生成，损伤明显加重。在缺血-再灌注心肌，NO产生大量增加，应用NOS抑制剂L-单甲基精氨酸(L-NMMA)和L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)抑制NO的产生，能够减低心肌损伤[10]；也有研究[11]发现这些过量NO的产生系心肌iNOS活性升高所致，过量NO参与心肌脂质过氧化，损伤心肌。

本实验研究表明，缺血再灌注的心肌iNOS mRNA表达升高，eNOS mRNA表达降低，再灌注期间NO生成减少，CK-MB生成增加。而芦丁对缺血再灌注心肌有保护作用，其保护作用可能与调节iNOS和eNOS mRNA表达，调节NO生成有关。

[1] USHIDA Y，MATSUI T，TANAKA M，et al.Endothelium-dependent vasorelaxation effect of rutin-free tartary buckwheat extract in isolated rat thoracic aorta[J].J Nutr Biochem，2008，19(10)：700-707.

[2] KNEKT P，KUMPULAINEN J，JARVINEN R，et al.Flavonoid intake and risk of chronic diseases[J].Am J Clin Nutr，2002，76(3)：560-568.

[3] KORKMAZ A，KOLANKAYA D.Protective effect of rutin on the ischemia/reperfusion induced damage in rat kidney[J].J Surg Res，2010，164(2)：309-315.

[4] 黄金珠.芦丁对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国现代药物应用，2012，6(16)：131-132.

[5] PALMER RM，FERRIGE AG，MONCADA S.Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium derived relaxing factor[J].Nature，1987，327(6122)：524-526.

[6] OKAYAMA N，GRISHAM MB，KENVIL CG，et al.Effect of reactive oxygen metabolites on endothelial permeability：role of Nitric oxide and iron[J].Microcirculation，1999，6(2)：107-116.

[7] VEGH A，SZEKERES L，PARRAT J.Preconditioning of the ischemic myocardium；involvement of the L-arginine nitric oxide pathway[J].Br J Pharmacal，1992，107(3)：648-652.

[8] PABLA R，CURTIS MJ.Effect of endogenous nitric oxide on cardiac systolic and diastolic function during ischemia and reperfusion in the rat isolated perfused heart[J].J Mol Cell Cardial，1996，28(10)：2111-2121.

[9] Di NAPOLI P，TACCARDI AA，GRILLI A，et al.Chronic treatment with rosuvastatin modulates nitric oxide synthase expression and reduces ischemia-reperfusion injury in rat hearts[J].Cardiovasc Res，2005，66(3)：462-471.

[10]ZHANG Y，BISSING JW，XU L，et al.Nitric oxide synthase inhibitors decrease coronary sinus free radical concentration and ameliorate myocardial stunning in an ischemia-reperfusion model[J].J Am Coll Cardiol，2001，38(2)：546-554.

[11]LIU P，HOCK CE，NAGELE R，et al.Formation of nitric oxide，superoxide，and peroxynitrite in myocardial ischemia-reperfusion injury in rats[J].Am J Physiol，1997，272(5 Pt2)：H2327-2336.