老年白内障晶状体上皮细胞中caspase-3、Fas/FasL的表达及意义*

李延辉 叶仕英 何小杰 徐飞 袁煜宗

老年白内障是目前世界上第一位致盲眼病，其发病机制十分复杂，目前临床上尚无切实有效的预防药物。因此，通过各种先进研究技术的综合应用深入老年白内障发病机制，抓住凋亡相关基因在老年白内障发生发展中的作用机制从而研发相关分子作用靶点，已成为一项十分有益于防治老年白内障的的课题[1-2]。Caspase是一组半胱氨酸蛋白酶家族，近年来相关资料显示，caspase-3可能参与了LECs的凋亡和白内障的形成[3-4]。目前对Fas/FasL系统的凋亡机制研究多数集中于其在肿瘤发病机制中的作用及意义，而对该系统在老年白内障发生过程中的作用机制尚不明确[5-6]。本研究通过免疫组化法对老年白内障患者及正常老年人的晶状体上皮中caspase-3、Fas/FasL的表达水平进行检测，旨在初步探讨caspase-3、Fas/FasL在老年白内障发生过程中所具有的分子生物学功能，为预防老年白内障发生及开发更有效的药物治疗提供新的实验依据和思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2007年9月-2012年2月本院眼科收治的老年白内障患者25例为研究对象，其中男13例（13眼），女12例（12眼），年龄50~79岁，平均（62.4±2.6）岁。均在常规白内障显微手术过程中采用连续环形撕囊，晶状体前囊膜的直径约5 mm。另选择暨南大学附属第一医院病理科进行老年人尸体解剖的眼球晶状体前囊膜标本10例，均证实无白内障发生。两组晶状体前囊膜标本均经10%中性缓冲甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片。

1.2 方法

1.2.1 TUNEL方法检测细胞凋亡 采用TUNEL法检测四组晶状体前囊膜标本中的细胞凋亡情况。TUNEL法试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，操作方法及过程严格按照试剂盒要求步骤进行。检测结果判定：光镜下观察，LECs细胞核出现棕黄色颗粒者为凋亡细胞，而染为蓝色的细胞核为正常LECs细胞。每张切片随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，计算凋亡细胞百分率：细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.2 免疫组织化学检测 采用免疫组化EnVision法检测各组LECs中caspase-3、Fas/FasL的表达。操作方法及过程严格按照EnVision法试剂盒要求步骤进行。染色结果判断[6]：LECs胞浆或胞膜内见黄色或棕色颗粒为染色阳性。每张切片随机选择检查5个视野，计数100个细胞，计数阳性细胞数，计算阳性细胞率。0%~5%为（-）；5%~10%为（+）；20%~35%为（++）；35%~50%为（+++）。（+）~（+++）记为阳性。1.3 统计学处理 采用SPSS 12.0版统计软件进行数据整理分析，计量资料比较采用方差分析，计数资料比较采用 字2检验，各指标之间关系分析采用等级相关检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组LECs的凋亡情况比较 研究组、对照组的LECs中凋亡细胞百分率分别为34.0%、2.0%。研究组凋亡细胞百分率显著高于对照组，差异有统计学意义（t=11.59，P<0.01）。

2.2 两组LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的表达比较 研究组LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的阳性表达率分别为84.0%、60.0%、68.0%，而老年对照组LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的阳性表达率为10.0%、10.0%、20.0%，两组caspase-3、Fas、FasL蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（ 字2=6.19、8.43、9.11，P<0.01）。见表 1。

表1 两组LECs中caspase-3、Fas、FasL蛋白的表达水平比较

2.3 LECs凋亡与caspase-3和Fas、FasL表达之间的关系 对LECs凋亡与caspase-3和Fas、FasL表达之间的关系进行了分析，发现在25例老年性白内障患者中，LECs凋亡与caspase-3和Fas、FasL表达水平均成正相关的关系（r=0.621、0.583、0.621，P<0.01）。

3 讨论

近年来研究表明，LECs的损害是白内障发生过程中的早期事件，除先天性白内障以外，其他类型的白内障形成均与LECs发生凋亡密切相关。推测LECs发生凋亡后，致使LECs的密度降低，LECs下面的晶状体纤维渗透压失去平衡，最终部分晶状体纤维的透明性和完整性受到不好的影响[7-8]。本研究结果显示，研究组、对照组的LECs中凋亡细胞百分率分别为34.0%、2.0%。两组凋亡细胞百分率比较，研究组显著高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.01）。提示在老年白内障的发生过程中，LECs发生凋亡可能是其细胞学基础，在其中可能起重要的作用。

caspase-3是近年来发现执行哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶[9-10]，国外有研究发现，在亚硒酸盐诱导大鼠晶状体上皮细胞凋亡过程中，caspase-3酶活性增高并起关键作用，提示caspase-3可能参与了晶状体上皮细胞凋亡和白内障的形成。国内一些研究结果也发现caspase-3在白内障的发病机制中占有重要地位。研究认为促凋亡基因Fas与FasL的相互作用及其构成的复杂体系，是多种细胞凋亡的发生机制之一[11-12]。Fas属于TNF家族的I型跨膜糖蛋白，而FasL属于TNF家族的II型膜蛋白。两者结合在凋亡过程中具有诱导细胞发生凋亡的作用。目前对Fas/FasL系统的凋亡机制研究多数集中于其在肿瘤发病机制中的作用及意义，而对该系统在白内障发生过程中的作用机制尚不明确。

本研究采用免疫组化法检测老年白内障患者及正常老年人的晶状体上皮中凋亡相关基因caspase-3、Fas/FasL的表达情况，结果表明两组caspase-3、Fas、FasL蛋白阳性表达率比较，差异有统计学意义（P<0.01），老年性白内障患者LECs中caspase-3、Fas、FasL的阳性表达率均明显高于正常老年对照组，同时对LECs凋亡与caspase-3和Fas、FasL表达之间的关系进行了分析，发现在25例老年性白内障患者中，LECs凋亡与caspase-3和Fas、FasL表达水平均成正相关的关系（r=0.621、0.583、0.621，P<0.01）。这提示caspase-3、Fas/FasL均可能参与了老年白内障形成过程，且在老年性白内障形成过程中具有比较重要的作用。推测LECs受到外界各种不同刺激后，caspase-3蛋白酶系统首先被激活，晶状体内外钙离子流动失去正常时的平稳状况，细胞骨架及晶体连接蛋白逐渐被降解；同时也激活了FasL-Fas系统，大量FasL-Fas表达并结合，从而提供诱导凋亡的传导信号，晶体连接蛋白进一步被降解，水电平衡失调以及LECs发生大量凋亡的病理改变，推动白内障的形成进程[13-15]。

综上所述，老年性白内障形成过程可能与LECs的凋亡及caspase-3、Fas/FasL的表达调控有关，相信随着对老年白内障形成机制的不断深入了解及凋亡机制的逐渐明确，调节caspase-3、Fas/FasL表达的相关分子靶点药物的进一步开发及应用，都将为预防老年白内障及其非手术治疗方案的研发提供新的指导方向。

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