南方红豆杉内生真菌分离时的表面消毒方法探索

李军勤, 殷小雯, 宋培勇*

1.遵义师范学院生命科学学院, 贵州 遵义 563002;

2.东北师范大学生命科学学院, 长春 130117

在我国分布有4种和1变种红豆杉，分别为中国红豆杉(Taxuschinensis)、东北红豆杉(Taxuscuspidata)、西藏红豆杉(Taxuswallichiana)、云南红豆杉(Taxusyunnanensis)和南方红豆杉(Taxuschinensisvar.mairei)。南方红豆杉是中国红豆杉的变种，又称美丽红豆杉，产于中国长江流域以南，常生于海拔1 000～1 200 m以下山林中，呈星散分布(如在贵州很多地区就有南方红豆杉的分布)，为我国特有，是公认濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物。有最佳抗癌药物之称的紫杉醇(paclitaxel，商品名 Taxol)最先就是从短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)中提取的[1]。1993年，Stierle等[2]第一次从太平洋紫杉植物体内分离出一种可产紫杉醇的内生真菌安德鲁紫衫菌(Taxomycesandreanae)，从此在国际上掀起了产紫杉醇内生真菌分离的热潮。植物表面消毒是分离植物内生菌的首要步骤，是利用物理或化学方法对植物体的表面进行清洗浸泡以杀死表面附生的细菌、病原真菌等部分微生物而不伤害植物体内所生存的微生物的过程，消毒的难点在于既要表面消毒彻底，又要保证植物体内的内生菌不受到伤害。因此要根据植物材料的不同，在消毒剂的种类、浓度和浸泡时间上做精心的选择和设计。目前使用的植物表面消毒技术大多使用升汞(HgCl2)[3～5]，而升汞有毒，并且还有一定的致癌性，因此开发更安全有效的植物表面消毒技术非常必要。鉴于有关植物内生菌分离时的表面消毒方法的系统报道[6，7]较少，本研究探索用2％ 次氯酸钠(NaClO)配合75％ 乙醇对南方红豆杉内生真菌分离时的植物材料进行表面消毒，主要在时间程序上进行摸索，以期为南方红豆杉内生真菌的相关研究提供基础方法。

1 材料与方法

1.1试验材料

试验所用材料南方红豆杉枝条和树皮，采集于贵州省凤冈县土溪镇官坝村谢家桥(2014年1月)、湄潭县西河乡龙孔村后头湾(2014年2月)和茅坪镇附近(2014年3月)，备用。

1.2培养基

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：按照《微生物学实验指导》[8]方法进行配制。

1.3材料预处理

将采集到的新鲜红豆杉枝、叶、皮(先去除老皮)用流水冲洗，晾干，修剪成1～2 cm长的小段或1 cm见方的小块。

1.4表面消毒试验

参考Guo等[9]和宋培勇等[10]的植物表面消毒方法，对南方红豆杉不同部位的外植体按以下程序进行表面消毒：将外植体(叶、茎和皮)在无菌水中漂洗3次，用75％乙醇浸泡3 min后，转入2％ NaClO进行浸泡处理，然后用75％乙醇对叶、茎和皮做浸泡处理，最后用无菌水漂洗3次。

1.5表面消毒条件研究

表面消毒步骤中,NaClO、乙醇浸泡处理时间对消毒效果有较大影响，分别设置不同消毒时间组合，考察消毒流程中时间设置对表面消毒效果的影响。NaClO浸泡时间设1 min、2 min和3 min共三个处理；75％乙醇浸泡根据不同外植体采用不同浸泡时间处理，见表1。

1.6内生菌培养

取按1.4方法表面消毒后的材料接PDA平板，每种处理的材料接3个平板，每个平板接同种处理材料3个，压紧压实后倒置于25℃生化培养箱中培养5～7 d。取每种处理的最后一次漂洗液0.1 mL涂2个平板作为对照组，以检验表面消毒效果。

表1 75％乙醇对不同外植体的浸泡消毒处理

2 结果与分析

2.1不同消毒程序对南方红豆杉叶的表面消毒效果

对南方红豆杉叶进行表面消毒，采用不同2％ NaClO和75％乙醇浸泡时间，表面消毒处理后的南方红豆杉叶在PDA培养基上培养5～7 d后观察，试验组和对照组平板上真菌生长情况见表2。

从表2可以看出，南方红豆杉叶采取“2％ NaClO处理1 min，75％乙醇处理0.5～3 min”，“2％ NaClO处理2 min，75％乙醇处理0.5～2 min”，消毒结束后仍有杂菌残留；“2％ NaClO处理3 min，75％乙醇处理3 min”，分离不到内生菌。因此，处理Ⅰ～Ⅶ和处理Ⅻ表面消毒全不合格。其他几种处理，达到的表面消毒效果彼此之间有差异，以处理Ⅷ“2％ NaClO处理2 min，75％乙醇处理3 min”，表面消毒效果最好。

2.2不同消毒程序对南方红豆杉茎的表面消毒效果

对南方红豆杉茎的表面消毒结果与叶相类似，见表3。以处理Ⅷ的效果最好，即，以“2％ NaClO处理2 min，75％乙醇处理5 min”处理红豆杉茎效果最佳。

2.3不同消毒程序对南方红豆杉皮的表面消毒效果

对南方红豆杉皮的表面消毒结果见表4。以处理Ⅷ的效果为最好，即，以“2％ NaClO处理2 min，75％乙醇处理7 min”处理红豆杉皮效果最佳。

表2 不同消毒程序对南方红豆杉叶的表面消毒效果

表3 不同消毒程序对南方红豆杉茎的表面消毒效果

表4 不同消毒程序对南方红豆杉皮的表面消毒效果

3 讨论

从叶、茎、皮表面消毒效果看，2％ NaClO的消毒时间1 min太短(消毒不彻底)，3 min太长(内生真菌损失严重)，而2 min比较合适，且2％ NaClO的消毒最佳时间与取材关系不大。从75％乙醇的消毒时间看，叶、茎和皮的最佳消毒时间分别是3 min、5 min和7 min，这说明材料不同，时间各异。试验组平板生长的内生真菌菌落数较多，同时对照组平板没有菌落生长被认为是内生菌分离的最好效果，以此为评判标准，分离南方红豆杉内生真菌的最佳表面消毒方法为：无菌水漂洗3次→75％乙醇浸泡3 min→2％ NaClO浸泡2 min→75％乙醇浸泡3～7 min(即叶3 min、茎5 min、皮7 min)→无菌水漂洗3次。

表面消毒是植物内生菌分离时一个非常重要的环节，旨在杀死植物表面附生菌的同时, 尽量保护植物内生菌不受伤害。不同的消毒剂类型、浓度和消毒时间等均直接影响表面消毒效果[11]。选用2％ NaClO和75％的乙醇进行组合设计用于植物内生菌分离时的表面消毒是可行而有效的，方法简便、安全、有效，既不对植物内生真菌造成过度伤害，也避免了植物体外附生菌的混杂。如，李晓红等[7]比较了不同的表面消毒方法对真菌出菌率的影响，结果表明用NaClO进行表面消毒，真菌的出菌率相对较高。姜国银等[6]比较了5种消毒剂的植物表面消毒效果，发现用75％乙醇溶液消毒1～2 min，4％ 或6％ NaClO消毒0.5～2 min都能从核桃树以及飞龙斩血植株样品中获得较多的内生菌。在以往从红豆杉分离内生真菌的研究中，仅采用70％乙醇表面消毒或70％乙醇表面消毒结合含抗生素的培养基，分离得到了一些内生真菌菌株[12～15]，但表面消毒效果差异还可能影响到后续内生菌分离鉴定的工作量，因此有必要寻找既能够彻底表面消毒，又不影响内生真菌的方法。本实验获得了适用于南方红豆杉内生真菌分离时的表面消毒方法，并发现消毒剂的处理时间对于从植株不同组织器官分离内生菌非常关键。不同植物、植物的不同器官以及内生菌的类别(真菌、细菌和放线菌)对消毒剂的敏感性不一样，对消毒剂的耐受时间也是有差异的，因此分离植物内生菌时应该根据实验目的、所用材料筛选出最佳的表面消毒方法。

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