基于基因突变的基因工程抗体亲和力成熟研究

邓 龙, 周 思, 郭新东

1.广东食品药品职业学院, 广州 510520;

2.广州质量监督检测研究院, 广州 510000

随着基因工程技术的不断发展，通过DNA重组技术获得抗体的基因片段，将重组抗体的基因转入原核或真核表达系统中在适当条件下表达，已获得一系列基因工程重组抗体。基因工程重组抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗体。其在基因水平上的操作非常灵活。可对基因序列进行分析、修饰和加工以改进抗体特性或赋予抗体新的特性，突破以往仅局限于半抗原分子设计的限制。针对基因工程抗体亲和力普遍较低；半衰期短，易从血中清除；缺乏Fc片段，只能中和抗原，而不能激活补体系统和介导细胞免疫等缺点，人们希望通过基因工程抗体的灵活性，将抗体进行定向的改造，达到优化抗体的目的。

近年来，利用信息技术剖析生命现象的本质成为生命科学工作者所关注的焦点，也由此产生了一门计算机技术与生物学技术相结合的新兴学科——生物信息学。要实现基因工程抗体的定向进化需要充分利用计算机模拟、X射线衍射(X-ray)、多维核磁共振(multidimentional NMR spectroscopy)等结构测定技术，通过生物信息学手段分析小分子有机物与抗体相互作用机制，在此基础上对抗体的基因序列进行修饰、改造，从而达到改进基因工程抗体的目的。

基因工程抗体要进行体外抗体亲和力成熟，就必须对体内抗体亲和力成熟原理有深入认识，模拟亲和力成熟过程中体内存在的变化，促使基因工程抗体的体外进化，才是解决问题的关键[1]。

1 小分子有机物—抗体相互作用机制分析

随着抗体信息学的广泛开展，现已经有几种专门针对抗体序列进行分析的数据库及分析工具，如Kabat数据库、NCBI数据库里的Immunoglobin BLAST (IgBlast)、VBASE数据库，以及IMGT数据库等。研究者可在获得抗体序列的基础上，利用这些数据库及相应的分析工具进行序列比对以及其他特征的分析。与此同时，在计算机模拟平台上，研究抗原和抗体的相互作用机制，特别小分子有机物和相应的抗体的相互作用机制已经受到了相当大的关注[2～4]。近年来，借助同源模建(homology modelling)及X射线衍射手段获取抗体模型，并利用分子动力学、定点突变等技术已经对多种小分子有机物和相应抗体的相互作用机制进行了详细的研究(见表1)[5～13]，揭示了小分子有机物和相应抗体的相互作用本质。

抗原与抗体间的特异性结合，可用“模板学说”或“锁与钥匙学说”来描述[14，15]。通过分子生物学与X射线衍射、多维核磁共振(NMR)等相结合的大分子结构测定技术，许多抗体大分子或者抗体-抗原复合物的三维结构己被测定[16，17]。而对已知一级结构的抗体分子，可采用理论方法、分子模拟方法(如同源蛋白模建方法)预测其三维结构[18]。目前应用较多的在线同源模建工作站有SWISS-MODEL、web of antibody model和Rosetta antibody model server等。获得抗体模型后，借助各种手段来阐明抗原抗体识别机制，可以指导小分子有机物特异抗体的制备，如交叉反应的避免和抗体亲和力的提高等。Hofstetter等[19]分别将氨基酸异构体衍生化后得到的抗原注入动物体内而培养出相应的抗氨基酸的抗体，再将得到的对映异构体的抗体用来识别该氨基酸异构体。而在抗体亲和力的提高上，Scotti等[20]通过分析两个不同亲和力的抗苯基唑酮抗体的基因序列，发现高亲和力抗体和低亲和力抗体的序列基本相同，只存在9个氨基酸残基的差异，这些氨基酸残基差异都位于抗体的重链区。通过X射线衍射对抗原与抗体结合体进行结构分析，发现表面互补性提高使抗体获得了较高的亲和力，这意味着表面互补性对抗体亲和力的成熟具有重要的作用。

表1 抗体与小分子相互作用机制研究

2 基因工程抗体的亲和力成熟研究

抗体的亲和力一般用亲和常数Ka或者解离常数Kd来表示，可以反映抗原和抗体的结合程度。抗体亲和力成熟(antibody affinity maturation) 是指机体正常存在的一种免疫功能状态。在体液免疫中，再次应答所产生抗体的平均亲和力高于初次免疫应答，这种现象称为抗体亲和力成熟。这是由于抗体形成细胞本身的基因突变和抗原对B 细胞克隆的选择性激活。机体的这种功能状态是长期进化和对外界环境不断适应的结果，对机体防御和维持自身免疫监控有着十分重要的意义[21]。

随着人们对体内抗体亲和力成熟的深入研究，体外抗体亲和力成熟研究已经成为一个研究热点。由于抗体的成分绝大部分为蛋白质，因此体外抗体亲和力成熟可归属于体外功能蛋白质分子进化的范畴。体外抗体亲和力成熟一般可以采用随机突变编码可变区的基因片段的方法和定向引入突变(site-directed mutagenesis)的方法及近来研究比较热门的基于抗原结合位点结构调整的方法。

2.1随机突变法

采用随机突变编码可变区的基因片段的方法一般又有错配PCR法(error-prone PCR)、DNA改组法(DNA shuffling)和链置换法(chain shuffling)等。错配PCR法通过改变PCR 的条件，使目的基因片段在复制的过程中碱基对发生错误的配对，从而引入突变。Finlay等[22]以随机突变为基础，联合运用错误倾向PCR、DNA 重组等方法，使亲和力提高了110倍。DNA 改组法同样运用随机突变的原理，在获得较大容量的功能蛋白质突变体库的基础上，结合运用相应的快速富集筛选方法(主要是以噬菌体表面展示为主的各种表面展示技术) 对突变体进行筛选，最终得到进化的功能蛋白质分子。Kim等[23]结合噬菌体库展示技术通过DNA 改组把抗体亲和力提高了9倍。链置换则依据抗体可变区随机配对的原理，在抗体的一条链保持不变的情况下，将另一条链进行替换，之后从中筛选出高亲和力的抗体分子。Hur等[24]运用链置换技术成功将一个天然抗体的亲和力提高了36倍，同时获得了抗体片段在大肠杆菌中的可溶性表达。总体来看，采用随机突变编码可变区的基因片段的方法，随着研究人员的不断改进，该技术有了长足的发展，但是此方法始终有着盲目和随机性的缺点，使得在相关的研究中对突变的结果较难把握。

2.2定向突变方法

采用定向引入突变的方法的前提是对基因及表达的蛋白产物的三维结构和功能等方面的信息有着较为透彻的了解。研究表明，抗体的互补决定区集中在一起形成一个特定的三维结构，其中包含了一个和抗原结合的部位，同时互补决定区突变的频率也最为频繁，通过对抗原抗体结合部位的晶体结构的分析，在一定程度上可提示出哪些特定部位的氨基酸残基可以优先突变来提高亲和力。近年来，借助计算机软件同源模建技术，在模拟抗原抗体结合过程中的构象及能态的变化的基础上有针对性地对互补决定区的基因进行突变，已成为一个研究的热点。Akikazu等[25]通过对一株抗乙酰胆碱Fab重链95位上的酪氨酸进行定点突变，替换成为甘氨酸之后，突变体亲和力提高了100倍。对于如何选取针对性的突变点，丙氨酸扫描法(alanine scanning)具有一定的优势。丙氨酸扫描突变采用体外定向突变的策略，通过改变密码子的序列，系统地将丙氨酸置换特殊的氨基酸，然后通过测定抗原抗体解离速率是否下降来确定可进一步优化的氨基酸(optimized residue substitution，ORS)，同时对它们进行随机的突变，可筛选得到解离速率最低的氨基酸，最后仅通过选定氨基酸的置换来提高抗体亲和力[26，27]。此方法目的明确，绕开了不好选择突变频率的难题，同时避免了随机突变编码可变区基因片段法随意性大的缺点。

2.3基于抗原结合位点结构调整的方法

通过对抗体亲和力成熟的深入研究，已发现抗原结合位点处的氨基酸对抗体亲和力具有显著的作用。Li等[28]首次运用X射线晶体衍射技术，通过研究抗原-抗体结合的三维构象来研究抗体亲和力成熟的过程，研究表明，抗原和抗体的结合面积的加大在抗体亲和力成熟过程中并不出现，而可能是抗原结合位点周围的一些氨基酸残基的变化增加了疏水性作用力，从而使抗原和抗体的结合更加紧密，互补性增强。Cauerhff等[29]的研究也表明，抗体亲和力成熟更重要的可能是一些小结构的变化，尤其是分布在抗原结合部位周围一些位点，而这些小的变化使得抗体和抗原结合部位从构象上来说更加契合抗原的三维结构，两者互补性更趋完善。Yau等[30]也发现热点突变对亲和力提高可能是通过突变使得可变区的可溶性和结构方面的物理特性产生了积极的影响，这意味着如果能够充分了解抗体亲和力成熟的过程中真实的结构水平和能量转化上的改变，就能理性地提出对抗体亲和力体外成熟的可控策略。近年来，借助计算机模拟技术，通过同源模建获取抗体模型，并分析抗原抗体结合活性位点，探究抗原与抗体之间的相互作用，并对抗体的氨基酸序列进行修改，提高抗体亲和力，已经成为一种重要的手段[31～35]。

3 展望

分子模拟和计算机辅助抗体进化是当前计算机科学与生物学相结合研究的重要体现，目前该技术运用主要表现在两个方面：一是用分子动力学模拟方法对抗体进行动态的模拟，借助计算机理论模型和数据库分析，直接从抗体的氨基酸序列预测抗体三维结构以及动力学特征，通过计算模拟抗原和抗体间的分子识别，了解抗体结构与功能的关系；二是通过分子模拟技术充分计算抗原抗体在结合过程中的能量变化，找出二者结合的关键位点及重要的能量变化过程，借助抗体数据库，通过对关键位点的氨基酸的调整，筛选出更加合理的抗体构象，增强抗体的某种属性[36～38]。

抗体作为医药、食品安全领域等研究领域重要的“原材料”，其重要性不言而喻。但是，基因工程抗体的广泛应用却受限于其抗原结合能力不强的问题。值得庆幸的是，基因工程抗体容易在分子和基因水平上进行修饰和改造，这为体外进行抗体亲和力成熟提供了可能。另外体外提高抗体亲和力的方法实际上都是模仿体内抗体的成熟过程，随着分子模拟技术的发展，利用分子对接等手段针对基因工程抗体的序列进行改造将为抗体定向进化提供广阔的应用前景[39～42]。

通过分子模拟技术对基因工程抗体进行改造仅仅是分子模拟技术运用的一个体现，作为交叉学科的一项重要的技术，分子模拟技术在生物学、物理学及材料学等交叉领域的发展仍旧需要我们进一步研究和探索[43]。

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