大肠杆菌和酵母表达系统的研究进展

张云鹏, 温 彤, 姜 伟

中国农业大学农业生物技术国家重点实验室, 北京 100193

在发酵工业中，菌种无疑是影响产物产量和质量最重要的因素之一。早期研究中通常通过定向筛选自然突变的方法得到发酵菌种，此种方法耗时长、效率低。随后出现的物理/化学诱变技术提高了菌种筛选的速度，提高了筛选及生产效率。从20世纪70年代起，随着分子生物学及基因组学的快速发展，各种工程菌株遗传操作体系的完善，已能十分方便地利用微生物进行多种蛋白质疫苗、核酸疫苗和酶制剂等的发酵生产。利用原核及真核表达系统和高度发展的自控发酵设备生产各种发酵产物是近十年来发酵工业最为活跃的领域之一。本文从表达载体和宿主菌改造两方面综述了大肠杆菌和酵母工程菌株构建与改造的新进展与新技术。

1 大肠杆菌表达系统研究进展

1.1大肠杆菌表达载体的构建与评价

以大肠杆菌为代表的原核生物由于易于培养、生长速度快等优势成为原核工程菌的代表菌株。大肠杆菌中应用最普遍的工程菌是大肠杆菌BL21(DE3)。BL21是λDE3大肠杆菌溶源菌，包含受控于lacUV5启动子的T7 RNA聚合酶表达基因，在有乳糖或IPTG存在的情况下表达T7 RNA聚合酶，可以快速大量地启动T7启动子下游基因的表达。在过去20年中广泛应用的表达载体主要有pGEX系列、pQE系列与pET系列。目前pET系列仍然是普遍使用的一种高效表达载体。pET表达系统的表达原理主要是应用LacI/Pt7lac启动子，使得目的基因在有诱导物的情况下大量表达。但是在这种外源蛋白大量表达的情况下，过量表达的目的蛋白很容易导致包涵体的形成。为了改变这种情况，英潍捷基公司(Invitrogen Co.)在pET表达载体基础上开发了pET SUMO表达系统。这个表达系统在目的蛋白前加入了SUMO元件以提高目的蛋白的溶解性。在目的蛋白的纯化过程中可利用SUMO蛋白酶将SUMO元件切下以得到原始蛋白。pET SUMO载体图谱如图1所示[1]。

图1 pET SUMO质粒图谱[1]

2013年，Balzer等[2]通过构建一系列的表达载体评价了5个调节子/启动子组合XylS/Pm(野生型)、XylS/PmML1-17(Pm突变体)、LacI/PT7lac、LacI/Ptrc和AraC/PBAD的转录效率和表达效率。他们发现：在5个调节子/启动子组合中目的基因的表达效率与质粒的拷贝数有关；LacI/PT7lac的转录活性最高；而LacI/PT7lac和XylS/PmML1-17表达活性蛋白的能力高于其余3组启动子；在5组启动子中XylS/PmML1-17的应用最灵活，因为其对宿主菌的要求比较低；AraC/PBAD启动子在不受诱导物诱导的情况下表达量最低，说明其下游基因的表达是受到严格调控的，并且这个启动子具有最高效的5′UTR。

1.2大肠杆菌表达系统的优化

为了提高蛋白的表达量，并使蛋白正确的折叠，具有蛋白活性，研究人员进行了一系列的尝试。Lopez等[3]通过突变RNA酶延长了mRNA的半衰期，从而延长蛋白翻译的时间，使得MukB蛋白的表达量提高了2倍；利用某些分子伴侣蛋白可以帮助目的蛋白折叠的特性[4]，将这些分子伴侣与目的蛋白共表达以促进蛋白的折叠；Bessette等[5]通过突变大肠杆菌中与氧化还原相关的蛋白使大肠杆菌胞质处于氧化状态，促进了带有二硫键的蛋白的表达；Wacker等[6]通过将pGL操纵元导入大肠杆菌解决了大肠杆菌表达蛋白N端糖基化的问题；Johnson等[7]最近发现将目的蛋白与酵母中NatB蛋白以及其底物蛋白共表达可以解决大肠杆菌表达人与酵母中部分乙酰化蛋白的问题。

除了对外源载体以及分子伴侣进行研究外，对于宿主菌的改造也是原核表达载体改造中的重要一环。对于宿主菌的改造主要是通过对宿主菌随机突变数据库进行筛选得到高效表达的菌株，随后再通过对高效表达的菌株进行基因组水平的分析，找到突变基因，分析其在宿主菌代谢调控中所起到的作用[8]，通过从表型反推基因型的正向遗传学方法可以使我们对于某个基因在代谢过程中所起到的作用有更深刻的理解。目前，比较好的筛选数据库主要是Keio数据库，其中包含了大肠杆菌K-12的所有非致死突变[9]，为大肠杆菌宿主菌改造提供了极大的便利。最近，Bowie等[10]通过碱基类似物2-氨基嘌呤突变以及突变基因mutD5的应用对大肠杆菌TOP10进行了突变，使得其对一系列真核和原核基因的表达量提高了90倍；Makino等[11]利用化学诱变的方法对大肠杆菌进行改造使得其表达IgG的能力提高了5倍。

大肠杆菌表达外源蛋白的研究已经非常成熟，为科学研究和发酵生产行为提供了极大的便利，但是仍然有一部分与外源蛋白表达相关的调控通路未知，需要进一步的探究。

2 酵母表达系统研究进展

酵母表达体系是目前工业生产中非常重要的一种真核表达体系，可以通过分泌途径将目的蛋白分泌出菌体外，提取程序简便，为工业生产提供了极大便利，并且在发酵生产安全性要求高的蛋白产品(如食品、药品等)方面具有不可比拟的优势。近些年来，药用蛋白在临床医学中的作用越来越大，据估计其市场价值可达到每年700亿～800亿美元，并且以每年7％～15％的速度增长[12,13]。尽管原核表达体系已经得到了长足的发展，并且也可进行一系列的糖基化或乙酰化的修饰，但其在药物蛋白表达领域仍然具有一定的局限性与缺陷。就目前而言，考虑到药用蛋白的安全性与某些蛋白的特殊性，部分表达宿主还优先选择真核生物，如酵母工程菌株。药用蛋白表达宿主酵母菌主要有酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、毕赤酵母(Pichiapastoris)以及耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)，其中以酿酒酵母的应用最为广泛。1996年酿酒酵母基因组作为第一个真核基因组发布[14]，促进了酵母遗传学的研究，也为将酿酒酵母作为药用蛋白表达宿主打下了坚实的基础。

2.1酵母表达载体

在酿酒酵母表达系统中，常用的表达质粒是pYC2-E(见图2A)[15]。在这个表达载体中，目的蛋白的表达受到半乳糖激酶启动子的控制，当有半乳糖存在时，宿主菌表达半乳糖激酶以分解半乳糖获得能量，同时启动半乳糖激酶启动子下游基因的转录，达到外源蛋白表达的目的。在毕赤酵母表达系统中，英潍捷基公司提供的表达载体主要有诱导型表达载体和组成型表达载体两种。组成型表达载体pGAPZ(见图2B)[16]以3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子为外源蛋白表达启动子，不需要诱导。而诱导型表达载体pPICZα(见图2C)[17]以醇氧化酶基因AOX1启动子启动外源基因的表达，只有在甲醇存在的情况下外源基因才能开始转录。

图2 酿酒酵母表达质粒pYC2-E，毕赤酵母组成型表达载体pGAPZ和诱导型表达载体pPICZα质粒图谱[15～17]

2.2目的基因表达框的改造

为了提高外源蛋白在酵母中表达量，首先应对目的蛋白基因的启动子进行改造或替换。在酿酒酵母中常用的高效表达启动子主要是TEF1和GPD(TDH3)。近些年来，主要通过随机合成寡核苷酸技术[18]和错配PCR技术[19]对这些启动子进行突变，以期得到表达活性更高的启动子。在毕赤酵母中，三磷酸甘油醛启动子GAP的转录活性也通过随机突变的方法得到了提高[20]。

除了以上的组成型表达启动子外，也有诱导表达启动子。在酿酒酵母中常用的诱导表达启动子主要是GAL1和GAL10。由于这两个启动子的诱导物是半乳糖，半乳糖可以当做酵母的碳源而被消耗导致对基因表达的控制变得复杂，加之半乳糖价格较贵，阻碍了这两个启动子在工业生产中的应用。最近，McIsaac等[21]将6个Zif268结合位点与一个经过改造的GAL1启动子联合使用，使得GAL1在Z3EV转录因子存在时的表达更可控。在毕赤酵母中，最常用的诱导型启动子是AOX1启动子。由于AOX1启动子是甲醇诱导型启动子，在工业生产中使用甲醇存在安全隐患，所以现已通过对启动子进行改造以提高其转录效率并改变其甲醇诱导的特性[22]。

在酵母表达体系中除了启动子因素外，密码子偏好性和质粒拷贝数也是影响外源蛋白表达的重要因素。通过对目的基因的密码子进行优化，使其更适应宿主的密码子偏好性，并通过改变A/T，C/G比例可以有效提高外源蛋白的表达效率。在质粒拷贝数方面，高拷贝的质粒有利于蛋白的大量表达，但是过量的蛋白表达会加重宿主负担，使得表达体系不稳定。通常情况下，将表达载体重组在宿主的基因组上有利于外源基因的稳定性。但是最近发现，在酵母中，很多时候质粒拷贝数并不与蛋白的表达量成正比[23]。

2.3宿主菌的改造

在酵母表达体系的研究过程中，宿主菌的改造同样也是研究的一个重要方向。

由于在酵母中表达的很多外源蛋白会分泌到细胞外，所以对酵母分泌途径的改造可以有效提高目的蛋白的产量。蛋白的表达和分泌主要包括转录、翻译、肽段转移、翻译后修饰、蛋白折叠、肽段切除、糖基化、包装和分泌等步骤[24]。翻译后蛋白首先被转移到内质网中，在这个过程中，信号肽与前导肽起到关键作用。人工合成的缺少N端保守糖基化的α-交配因子的前导肽与酿酒酵母本身的前导肽在引导胰岛素分泌的过程中具有类似的活性[25]。在内质网中，蛋白的正确折叠是非常重要的，它决定蛋白进入分泌途径还是降解途径，肽段的错误折叠会加重内质网腔内的代谢负担，引起未折叠蛋白反应[26,27]。过量表达内质网中蛋白质折叠因子和还原酶可以有效改善内质网环境，促进蛋白质的折叠，从而提高蛋白质的分泌量[27～31]。在分泌途径的最后一步，蛋白质从内质网转移到高尔基体以及从高尔基体到细胞壁的囊泡运输过程中，两个关键蛋白Sly1P和Sec1P的过量表达同样可以有效促进蛋白的分泌[32]。

在酵母菌中，存在大量的蛋白酶表达，这些蛋白酶有些定位于蛋白分泌途径或作用于蛋白分泌途径[33]，导致外源蛋白表达后的折叠、糖基化等过程中可能会被错误剪切，直接导致蛋白表达量下降或活性下降。所以对酵母宿主菌中的蛋白酶系进行突变，可以有效减弱这一反应，从而提高外源蛋白表达的产量和质量。Cho等[34]通过对酿酒酵母中的天冬氨酸蛋白酶YPS1、YPS2、YPS3、YPS6和YPS7进行多点突变，使得在酿酒酵母中的甲状旁腺激素蛋白表达量有所上升。通过在其他酵母菌株中突变这些天冬氨酸蛋白酶，发现这些定位在细胞表面的天冬氨酸蛋白酶是外源蛋白被错误剪切的主要原因[35，36]。

近些年来，对酵母菌株的改造已不仅仅限于单个基因的缺失或过量表达，而是对一系列基因的共同改造，以提高外源蛋白的表达量和活性。

3 展望

近代以来，随着细菌纯培养技术的发展，代谢控制技术的建立，尤其是分子生物学的快速发展，发酵产业进入了高速发展的阶段，创造出了极大的经济价值，在食品、医药和保健等领域做出了巨大的贡献。

利用分子生物学手段，科学工作者构建了一系列的真核和原核表达体系。在大肠杆菌表达体系中采用技术主要包括启动子改造、共表达分子伴侣蛋白和筛选宿主菌株突变体库等；而在酵母菌表达体系中主要应用了随机突变与人工构建启动子、外源蛋白基因密码子优化、宿主菌代谢通路的改造与缺失等技术。尽管通过分子生物学手段构建了一系列的高效表达载体和适合的宿主菌，但是在各宿主菌中仍然存在一些没有研究透彻的调控通路，结合微生物代谢组等高通量技术，寻找代谢通路中的关键蛋白，对这些特定蛋白的过量表达与失活进行研究，有望进一步提高外源蛋白的表达量及活性。

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