腺病毒过表达TXNIP对INS-1胰岛细胞损伤和凋亡的影响

刘晓波 杨啸 姚艳玲 张倩 焦向英

基础研究

腺病毒过表达TXNIP对INS-1胰岛细胞损伤和凋亡的影响

刘晓波 杨啸 姚艳玲 张倩 焦向英

目的 观察TXNIP过表达是否可以引起正常培养条件下的胰岛细胞发生损伤和凋亡，分析TXNIP引起细胞损伤和凋亡的下游途径，以进一步明确TXNIP在糖尿病中引起各器官细胞损伤的机制。方法 将使用正常糖脂浓度培养的胰岛细胞分为4组：正常培养组、Ad-eGFP空病毒组、Ad-TXNIP过表达组和Ad-TXNIPC247S点突变过表达组。结果 与Ad-eGFP空病毒组相比，两个过表达组的TXNIP mRNA水平、TXNIP蛋白水平均显著升高，表明病毒转染成功，TXNIP成功过表达。与空病毒组相比，Ad-TXNIP过表达组TXNIP与Trx的结合量升高（1.67±0.08比1.06±0.05，P＜0.05），而 Trx活性显著降低（0.42±0.11比1.13±0.14，P＜0.01）；LDH 活性［（498.8±55.62）U/L 比（266.2±36.49）U/L，P＜0.01］、caspase-3 活性［（3.799±0.330）nmol·h-1·mg-1pro 比（0.979±0.100）nmol·h-1·mg-1pro，P＜0.01］及 p38 激酶活性（2.45±0.22 比 1.10±0.08，P＜0.01）均显著增高。与Ad-TXNIP过表达组相比，C247S点突变的TXNIP过表达组TXNIP与Trx的结合量减少，Trx活性明显升高，LDH 活性［（421.6±41.31）U/L 比（498.8±55.62）U/L，P＜0.05］和 caspase-3活性［（3.377±0.290）nmol·h-1·mg-1pro 比（3.799±0.330）nmol·h-1·mg-1pro，P＜0.01］较低，p38 激酶活性（0.80±0.07比2.45±0.22，P＞0.05）明显降低。结论 单纯过表达TXNIP可以引起正常糖脂浓度培养条件下的胰岛细胞发生损伤和凋亡。TXNIP介导细胞损伤和凋亡的机制一方面与其抑制Trx活性、增加自由基损伤、增加ASK1-p38激酶依赖的凋亡途径有关，同时也有不依赖结合抑制Trx的途径存在。TXNIP的表达上调是糖尿病引起胰岛细胞损伤和凋亡的重要原因。

硫氧还蛋白； 硫氧还蛋白相互作用蛋白； 胰岛细胞； 凋亡； 突变

近年来，全球糖尿病的发病率迅速升高，已成为威胁人类健康的重要疾病[1]。而我国又是全世界糖尿病患者最多的国家[2]。近年来有研究表明，在糖尿病患者和糖尿病动物的血清和组织中，硫氧还蛋白相互作用蛋白（Trx interacting protein，TXNIP）的表达显著增高，是最突出的变化之一。TXNIP是目前已知的唯一一种内源性硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）的结合抑制蛋白[3]，它可通过其第247位的半胱氨酸与还原型的Trx之Cys32或Cys35结合[4]，从而削弱其抗自由基和抗凋亡作用，引起细胞损伤和凋亡。

本实验室前期观察到使用RNA干扰抑制高糖诱导的H9C2细胞TXNIP表达上调后，细胞Trx活性显著提高，高糖高脂引起的心肌细胞凋亡显著减轻[5]。而在正常培养的H9C2转染过表达TXNIP的腺病毒，可使正常糖脂浓度培养条件下心肌细胞Trx活性显著降低，凋亡显著加重[6]。提示糖尿病可通过上调TXNIP表达，进而抑制Trx的活性，增加自由基损伤和激活p38激酶，引起心肌细胞发生损伤和凋亡。但作为一种ɑ-阻抑蛋白，TXNIP本身是否还可通过非Trx依赖的途径引起细胞凋亡和损伤，目前尚不清楚。因此，本课题使用247位半胱氨酸突变为丝氨酸，丧失与Trx结合能力的突变TXNIP过表达病毒，与非突变过表达病毒比较，转染INS-1细胞，以分析TXNIP对胰岛细胞的损伤作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 主要仪器和试剂 SW-CJ-2FD双人单面垂直净化工作台（苏州安泰空气净化有限公司），Heracell 150i CO2培养箱（美国THERMO ELECTRON公司），IX51倒置荧光显微镜（日本OLYMPUS公司），Mx3005P Real-Time PCR仪（美国STRATAGENE公司），S/N E10023酶标仪（美国Molecular Devices公司），BIO-RAD电泳仪和半干转印（美国BIO-RAD公司），JY92-2D超声波细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所），Kodak Image Station 400（美国 Kodak公司）。

INS-1胰岛细胞株购于中国科学院上海细胞库。1640培养基和胎牛血清（FBS）均购于Hyclone公司（美国），0.25%含EDTA胰酶购于Gibco公司（美国）。Ad-TXNIP-eGFP腺病毒、Ad-TXNIPc247s-eGFP点突变腺病毒和Ad-eGFP对照腺病毒与赛业（广州）生物科技有限公司合作构建获得，病毒滴度为1×1010pfu/ml。免疫共沉淀试剂盒购于Thermo公司（美国），乳酸脱氢酶测定试剂盒购于南京建成生物集团有限公司，p38激酶活性测定试剂盒和TXNIP一抗均为Cell Signaling公司（美国），Trx一抗购于 Millipore公司（美国），caspase-3活性试剂盒购自美国BIOMOL公司，RNA提取液（RNAiso Plus）购于上海生物工程有限公司。

1.1.2 INS-1胰岛细胞的培养及转染 用含10%FBS、抗生素（50 U/ml青霉素+50 U/ml链霉素）的1640培养基于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。处于对数生长期的细胞待长到80%满时进行传代和转染处理。传代时先用PBS冲洗2次，吸干PBS，加入400 μl 0.25%含EDTA胰酶室温下消化1 min，镜下观察大部分（80%～90%）细胞变圆，吸出胰酶，及时加入含10%FBS的1640培养基终止消化，轻轻吹打，传至2瓶，混合均匀后继续培养。

转染方法：前一天将细胞按1×106种于六孔板。第2天先吸出培养液，用PBS冲洗2次并吸干。按感染复数（MOI）=100，每孔 1 ml病毒稀释液（10 μl病毒混入990 μl不含FBS的1640培养基混匀液）进行转染，4 h后补含10%FBS的1640培养基继续培养，24 h后换液，24、48和72 h时分别观察转染效率，于转染效率最高时收集上清和细胞进行后续试验。

1.2 分组及方法

1.2.1 分组 将用正常糖脂浓度培养的INS-1胰岛细胞分为4组，即正常培养组、正常+Ad-eGFP空病毒组、正常+Ad-TXNIP-eGFP过表达组、正常+Ad-TXNIPC247S-eGFP点突变过表达组，均于转然后72 h收集培养基和细胞进行指标测定。

1.2.2 方法

1.2.2.1 荧光显微镜下观察并计算转染效率 利用荧光倒置显微镜拍摄同一个视野下的转染细胞，计算同一个视野下带绿色荧光蛋白细胞占整个视野下所有细胞的百分比即为转染效率。

1.2.2.2 Real-time PCR方法测定培养的INS-1胰岛细胞TXNIP的mRNA表达 INS-1细胞RNA提取使用RNAiso Plus，cDNA合成使用PrimeScriptTM RTreagent Kit。反转录反应条件为：37℃、15 min；85℃、5 s；4℃保存。Real-time PCR检测仪器为Mx3005P realtime PCR仪。反应条件：Segment 1为95℃、30 s，1个循环；Segment 2为95℃、5 s，60℃、20 s，40个循环；Segment 3为 95 ℃、1 min，55 ℃、30 s，95℃、30 s，1个循环。结果判定采用相对定量结果计算（2－ΔΔCt法）。所使用的相关基因引物序列 如 下 ：GAPDH 上 游 引 物 ：5′-2ATGGTGAAGGTCGGTGTG2-3′，GAPDH 下 游 引 物 ：5′-2AACTTGCCGTGGGTAGAG2-3′。TXNIP 上游引物：5′-GGCAATCAGTAGGCAAGTCTCCA-3′，TXNIP 下游引物：5′-TTCCGACATTCACCCAGCAA-3′。结果表示以正常对照组的平均值作为100%，计算其余各组与之相比的相对值。

1.2.2.3 Western blot方法测定培养72 h后INS-1胰岛细胞Trx1、TXNIP的蛋白表达 将转染72 h的细胞从孵箱里取出，吸出培养基，PBS清洗2遍，每皿内加入裂解液50 μl，吸入1.5 ml EP管内，超声波细胞粉碎机裂解细胞，并以10 000 rpm、4℃离心10 min，取上清液。用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，取等量蛋白（50 μg）进行 SDS-PAGE 电泳分离（BIO-RAD）。设置参数：80 V，预电泳20 min；进入分离胶后，120 V，电泳90～110 min。转膜参数为：15 V，20 min。将蛋白转移至PVDF膜（BIORAD）上，膜置于5%BSA封闭液中2 h。一抗孵育：用 TBST 稀释一抗（Trx：1∶2500；TXNIP：1∶1250；βactin：1∶1000），将封闭好的膜置于其中，4 ℃轻摇过夜，次日室温TBST轻摇洗膜4次，每次5 min。加入到相对应的辣根过氧化物酶标记的二抗（均为1∶2000稀释）于室温下孵育1.5 h。同样方法洗膜20 min。加入DAB显色液，室温下孵育3 min，用Kodak成像扫描仪扫描拍摄蛋白条带。以β-actin为内参照，实验在相同的条件下至少重复6次。结果表示以正常对照组的平均值作为100%，计算其余各组蛋白表达量与之相比的相对值。

【净点头介】是呀，这样人该杀的，小弟回去，即着人访拿。【向末介】老妹丈就此同行罢。【末】请舅翁先行一步，小弟随后就来。【副净向净介】小弟与令妹丈不啻同胞。

1.2.2.4 Trx与TXNIP结合检测 用预冷的PBS洗涤细胞2次、吸干，加入预冷的Lysis/Wash Buffer，用细胞刮子将细胞从培养皿上刮下，把悬液转到1.5 ml EP管中，4℃摇晃15 min，再4℃ 14 000 rpm离心15 min，取上清液，加入80 μlControl Agarose Resin 和100 μl Coupling Buffer，4 ℃摇晃30～60 min，然后4℃ 14 000 rpm离心10 min，去除Control A－garose Resin，取上清液，用BCA法做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度。每个反应体系柱里加入10 μl 1 μg/μl Trx 抗体，10 μl 20×Coupling Buffer，180 μl三蒸水，3 μl Sodium Cyanoborohydride Solution，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜，每个柱子中加200 μl Quenching Buffer和 3 μl Sodium Cyanoborohydride Solution孵育15 min后再用Coupling Buffer洗2遍珠子并离心去上清，每个柱子加入500 μg/200 μl样本，4℃缓慢摇动混合物过夜。加50 μl Elution Buffer游离抗原、抗体，收集上清液，电泳前加入Lane Marker Sample Buffer煮5 min变性，放置室温静止15 min后进行SDS-PAGE电泳。之后步骤参照1.2.2.3中TXNIP的蛋白表达量的检测。结果表示以正常对照组的平均值作为100%，计算其余各组蛋白表达量与之相比的相对值。

1.2.2.5 INS-1胰岛细胞硫氧还蛋白（Trx）活性的测定 用胰岛素还原法检测INS-1细胞Trx活性，即将胰岛细胞裂解液（以Cell signaling公司的cell lysis buffer常规提取细胞蛋白，并测定蛋白浓度）与胰岛素、TR和NADPH孵育。酶标仪检测412 nm处的OD值，计算出Trx的活性。结果表示以正常对照组的平均值作为100%，计算其余各组蛋白表达量与之相比的相对值。

1.2.2.6 培养基乳酸脱氢酶（LDH）活性测定 LDH广泛存在于人体各组织中，细胞损伤后，细胞内的LDH漏出到细胞外，因此可以通过测定培养基上清中LDH的活性反映胰岛细胞损伤的程度。本实验使用南京建成生物工程研究所乳酸脱氢酶测定试剂盒进行测定。LDH能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2’4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，在440 nm处有最大吸收峰，通过吸光度值可得出酶活力。收集各组细胞培养基上清0.5 ml，按乳酸脱氢酶测定试剂盒说明书操作并计算乳酸脱氢酶活性。

1.2.2.7 Caspase3活性测定 Caspase-3的活化是细胞凋亡的最终共有途径，可以反映凋亡发生的程度。取96孔酶标板，设立样品孔和标准品孔，向每个样品孔中分别加入2×反应缓冲液50 μl，样品裂解液 30 μl，蒸馏水 10 μl，底物（Ac-DEVD-AFC）工作液10 μl，振荡混匀；向标准品孔中加入不同浓度AFC标准品溶液100 μl，在酶标仪中37℃避光孵育1.5 h，于激发光Ex 400 nm、发射光Em 508 nm下每隔15 min连续检测其荧光密度值。以不同浓度AFC标准品读数作标准曲线。各样品caspase-3活性结果以每毫克蛋白单位时间分解底物Ac-DEVD-AFC而生成AFC的速度表示。计算公式：［AFC（1.5 h）－AFC（0 h）］/蛋白浓度/1.5 h（单位：nmol·h-1·mg-1protein）。

1.2.2.8 p38激酶活性测定 操作步骤严格按照cell signaling的 P38 MAP Kinase Assay Kit说明书进行。在待测蛋白样品中加入phosphor-38 MAPK抗体（每 200 μl细胞裂解物加 20 μl抗体），4 ℃轻摇过夜，14 000 g，30 s，4 ℃离心，弃上清，用 1×细胞裂解液和1×Kinase buffer各洗2次，用含ATP 200 mM 和 ATF 1 μl的 1×Kinase buffer 50 μl重悬沉淀，30℃ 孵育30 min，3×SDS样品缓冲液终止反应，煮样，95 ℃～100 ℃，2～5 min，用 Western immunoblot的方法检测ATF的表达量，用AlphaView Version 3.4.0.0图像分析软件进行条带分析。结果表示以正常对照组的平均值作为100%，计算其余各组与之相比的相对值。

1.3 统计学方法 应用统计软件SPSS 13.0进行统计分析。实验结果以±s表示，组间比较使用单因素方差分析，两两比较使用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光显微镜观察转染效率 镜下观察转染成功，24 h、48 h、72 h 转染效率分别 为 （9.97±2.15）%、（67.45±3.37）%、（89.96±4.32）%，其中转染72 h的转染效率显著高于转染24 h和转染48 h（P均＜0.01）。因此该实验我们选择转染72 h的细胞做后续实验分析。见图1。

2.2 Real-time PCR方法测定转染INS-1胰岛细胞TXNIP的mRNA表达 与正常培养组相比，AdeGFP组细胞TXNIP的mRNA水平无显著变化（1.07±0.17 比 1.00±0.22，P＞0.05）；过表达组与 AdeGFP组相比，TXNIP的 mRNA表达显著升高（1.89±0.26 比 1.07±0.22，P＜0.05），点突变过表达组与Ad-eGFP相比，TXNIP的mRNA表达显著升高（1.89±0.32 比 1.07±0.22，P＜0.05）。说明构建载体、病毒包装、细胞转染、过表达目的基因成功，且两个过表达组TXNIP的mRNA水平无明显差别。见图2。

2.3 Western Blot方法测定TXNIP和Trx蛋白表达 与正常对照组相比较，Ad-eGFP组的TXNIP蛋白表达无显著变化（1.04±0.05 比 1.00±0.04，P＞0.05）；而与Ad-eGFP组相比，过表达组和点突变过表达组的TXNIP蛋白水平均显著升高（1.92±0.07比 1.04±0.05，P＜0.01；1.69±0.17 比 1.04±0.05，P＜0.01），进一步说明病毒转染及蛋白过表达成功。与Ad-eGFP组相比较，过表达组和点突变过表达组的Trx蛋白表达均无明显变化（1.07±0.08比1.03±0.05，P＞0.05；1.09±0.07 比 1.03±0.05，P＞0.05），说明TXNIP表达增高并未抑制Trx蛋白表达。见图3。

2.4 免疫共沉淀检测TXNIP与Trx结合程度 与正常培养组相比，Ad-eGFP组Trx与TXNIP的结合量无明显变化（1.06±0.05 比 1.00±0.04，P＞0.05）；而与Ad-eGFP组相比、过表达组Trx与TXNIP的结合量显著升高 （1.67±0.08 比 1.06±0.05，P＜0.05）；点突变过表达组与Ad-eGFP组相比无明显变化（0.87±0.04 比 1.06±0.05，P＞0.05），提示点突变的过表达组的TXNIP不能与Trx相结合。见图4。

2.5 Trx活性测定 与正常培养组相比，Ad-eGFP组Trx活性无明显变化（1.13±0.14比1.00±0.12，P＞0.05）；与 Ad-eGFP组相比，过表达组 Trx活性显著降低（0.42±0.11 比 1.13±0.14，P＜0.01），提示TXNIP的过表达虽不会引起Trx蛋白表达量的改变，但是会明显抑制Trx的活性。点突变过表达组与Ad-eGFP组相比，Trx活性无明显变化（0.84±0.09 比 1.13±0.14，P＞0.05）；而与野生型过表达组相比，点突变过表达组细胞Trx活性明显升高（0.84±0.09比 0.42±0.11，P＜0.01），提示 TXNIP 主要通过其247位的半胱氨酸与还原型的Trx结合抑制其活性。见图5。

2.6 LDH活性的变化 与正常培养组相比，AdeGFP组LDH活性未见统计学差异［（295.6±37.22）U/L 比（266.2±36.49）U/L，P＞0.05］；过表达组与Ad-eGFP 组相比显著升高［（498.8±55.62）U/L 比（266.2±36.49）U/L，P＜0.01］，提示 TXNIP 表达增高可引起胰岛细胞损伤。点突变过表达组与Ad-eGFP组相比，LDH活性也明显升高［（421.6±41.31）U/L比（266.2±36.49）U/L，P＜0.05］；但与野生型过表达组相比，LDH 活性较低 ［（421.6±41.31）U/L 比（498.8±55.62）U/L，P＜0.05］，提示 TXNIP 可以通过Trx依赖和非Trx依赖两条途径引起胰岛细胞损伤。见图6。

2.7 Caspase-3活性测定 与正常培养组相比，Ad-eGFP组caspase-3活性未见统计学差异［（0.873±0.110）nmol·h-1·mg-1pro 比（0.979±0.100）nmol·h-1·mg-1pro，P＞0.05］；而过表达组与 AdeGFP组相比，caspase-3活性明显增高［（3.799±0.330）nmol·h-1·mg-1pro 比（0.979±0.100）nmol·h-1·mg-1pro，P＜0.01］，提示TXNIP过表达引起胰岛细胞显著凋亡。点突变过表达组与Ad-eGFP组相比，caspase-3活性明显升高［（3.377±0.290）U/L 比（0.979±0.100）nmol·h-1·mg-1pro，P＜0.01］；但与野生型过表达组相比，caspase-3活性较低［（3.377±0.290）U/L 比 （3.799±0.330）nmol·h-1·mg-1pro，P＜0.05］，提示TXNIP可以通过Trx依赖和非Trx依赖两条途径引起胰岛细胞凋亡。见图7。

2.8 p38激酶活性 与正常培养组相比，Ad-eGFP组p38激酶活性无明显改变（1.10±0.15比1.00±0.08，P＞0.05）；而过表达组与 Ad-eGFP 组相比 p38激酶活性显著升高（2.45±0.22 比 1.10±0.08，P＜0.01）。点突变过表达组与Ad-eGFP组相比，p38激酶活性无明显改变（0.80±0.07 比 1.10±0.08，P＞0.05），且明显低于野生型过表达组（0.80±0.07比2.45±0.22，P＜0.01）。提示 TXNIP 过表达引起的 p38激酶活化主要是通过结合和抑制Trx活性，增加自由基的生成和堆积所介导的。见图8。

3 讨论

本实验室近年对硫氧还蛋白系统变化与糖尿病心肌损伤的关系进行了大量研究。在前期使用糖尿病动物模型和模拟高糖、高脂刺激的培养细胞上，均发现TXNIP表达明显上调[7,8]，提示其与糖尿病及糖尿病引起的细胞损伤可能有着十分密切的关系。薛晓维等[5]在高糖、高脂培养的H9C2心肌细胞上，使用RNA干扰技术降低TXNIP的表达，我们观察到Trx的表达虽无显著的变化，但其活性明显增高，同时心肌细胞p38激酶的活性和凋亡也明显降低。在给予了外源性的Trx处理高糖、高脂刺激的培养细胞上，本实验室也观察到了类似的变化。但是并不清楚通过RNA干扰是阻断了高糖、高脂所引起的TXNIP的高表达，还是抑制了细胞内固有的TXNIP的表达进而产生保护作用。因此，姚艳玲等[6]又在正常糖脂浓度培养条件下对H9C2使用腺病毒转染技术使TXNIP基因过表达，观察到Trx的活性明显降低，同时心肌细胞的凋亡也明显升高，表明单纯TXNIP的表达增加即可造成细胞的损伤和凋亡。基于之前研究者对于TXNIP主要功能的认识，这两项研究均围绕TXNIP结合抑制Trx抗凋亡的作用进行研究，至于TXNIP是否可通过非Trx依赖的途径引起细胞凋亡，我们并不清楚。

因此，本实验中我们采用腺病毒使胰岛细胞分别过表达野生型TXNIP蛋白和C247S点突变的TXNIP蛋白，观察单纯野生型TXNIP蛋白增多，或者因C247S点突变而丧失与Trx结合能力的TXNIP蛋白增多时对正常糖脂浓度培养条件下的胰岛细胞损伤和凋亡的影响。实验发现，病毒转染组在转染72 h后转染效率达到高峰，野生型组与点突变组的TXNIP表达量较空病毒对照组mRNA水平和蛋白水平均显著升高，表明病毒转染是成功的。但点突变组与野生型组相比，TXNIP在mRNA水平未见明显差异，但在蛋白水平则相对较低，重复实验仍表现同样结果。参考Chutkow等[9]的研究报道，这可能是由于Trx与TXNIP的结合可以提高TXNIP的稳定性减少其降解造成的。TXNIP的降解依赖于TXNIP的C端PPXY结构与泛素等的结合，发生泛素化，并最终由蛋白酶体降解。Trx的32或35位半胱氨酸与TXNIP的247位半胱氨酸的结合可能引起TXNIP的C端PPXY结构折叠，阻止其泛素化降解。而突变的C247S的TXNIP，可能是由于丧失与Trx的结合，稳定性减弱，降解增加，造成其蛋白水平的降低。

通过对反映细胞损伤程度的LDH活性的测定，发现野生型组与点突变组均明显升高，同时反映细胞凋亡的capase-3活性两组也明显增加。由于使用的是正常糖脂浓度的DMEM培养基，因此排除了由高糖、高脂对细胞的影响，可以确定这种损伤和凋亡是由上调的TXNIP本身所引起的。

TXNIP是目前已知的唯一一种内源性的Trx结合抑制蛋白[3]。而Trx是一种巯基抗氧化蛋白，由于其细胞内表达量高，而且可借助NADPH和Trx还原酶的作用重新还原不断发挥抗自由基作用，因而在细胞的抗自由基损伤中发挥着重要作用[10]。我们首先使用免疫共沉淀方法反映TXNIP与Trx的结合程度。与空病毒组相比，野生型TXNIP过表达组二者的结合量明显升高，而点突变TXNIP过表达组与空病毒组相比结合程度无明显变化，提示C247S位点突变过表达的TXNIP不能与Trx相结合。通过测定Trx的活性和蛋白表达量，发现与空病毒组相比，野生型组Trx活性显著降低，而点突变组Trx活性无明显变化，综合TXNIP与Trx结合程度的结果，说明TXNIP通过其247位的半胱氨酸与还原型的Trx的Cys32或Cys35结合[4]，进而抑制其活性，而C247S突变的TXNIP确实失去了与Trx结合并抑制Trx功能的能力。Trx的蛋白表达量两组均未见明显变化，提示这种结合不影响Trx的蛋白表达。

从结构来看，TXNIP是一种α-阻抑蛋白，通过其N端的阻抑蛋白样结构域可能与多种蛋白产生相互作用[11]，因此TXNIP可能存在抑制Trx以外的其他作用途径。已有研究报道，TXNIP可抑制骨骼肌细胞[12]、成熟的脂肪细胞和皮肤成纤维细胞[13]的葡萄糖摄取，这些作用均与其对Trx的抑制作用无关。TXNIP通过何种不依赖于Trx结合抑制的途径促进凋亡，是否可以通过抑制胰岛细胞葡萄糖摄取促进细胞凋亡；同时糖尿病发病过程中机体产生大量炎性介质，TXNIP是否通过炎性介质影响凋亡，这些将在本实验室后续的实验中予以观察。

综上所述，本研究结果显示，单纯过表达TXNIP可以引起正常糖脂浓度培养条件下的胰岛细胞发生损伤和凋亡。TXNIP介导细胞损伤和凋亡的机制一方面与其抑制Trx活性、增加自由基损伤、增加ASK1-p38激酶依赖的凋亡途径有关，同时也有不依赖结合抑制Trx的途径存在。TXNIP的表达上调是糖尿病引起胰岛细胞损伤和凋亡的重要原因。

图1 转染72 h胰岛细胞转染效率

图2 Real-time PCR方法测定转染INS-1胰岛细胞TXNIP的mRNA表达

图3 -1 Western Blot方法测定TXNIP蛋白表达

图3 -2 Western Blot方法测定Trx蛋白表达

图5 Trx活性测定

图6 乳酸脱氢酶（LDH）活性的变化

图7 caspase-3活性测定

图8 p38激酶活性

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Effect of adenovirus-mediated TXNIP overexpression on apoptosis and injury of INS-1 islet cell

LIU Xiao-Bo，YANG Xiao，YAO Yan-Ling，et al.Department of Physiology，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

Objective To observe if TXNIP overexpression alone can cause islet cell apoptosis，Adenovirus carrying TXNIP gene was used to transfect INS-1 islet cells cultured in normal glucose and normal lipid concentration conditions.Meanwhile，adenovirus carrying a mutant C247S TXNIP gene，which lost its ability to attach and inhibit Trx by changing the cysteine at site 247 of TXNIP to serine，was also used to elucidate if TXNIP has additional effect on cell apoptosis independently of Trx.Methods INS-1 islet cells cultured in normal sugar conditions were randomly divided into four groups:normal cultured group，empty adenovirus vector group （AdeGFP），TXNIP overexpression group（Ad-TXNIP-eGFP）and C247S mutated TXNIP overexpression group.Results Compared with empty adenovirus vector group，TXNIP mRNA and protein expression level，the combination of Trx and TXNIP，LDH activity，caspase-3 activity and p38 kinase activity in TXNIP overexpression group were significantly increased，while the Trx activity decreased significantly.In C247S mutated TXNIP overexpression group，parameters such as TXNIP mRNA and protein expression level，LDH activity，caspase-3 activity were also signifi－cantly increased，however，the combination of Trx and TXNIP，Trx activity，p38 kinase activity were not changed.Compared with TXNIP overexpression group，C247S mutated TXNIP overexpression group showed increased Trx activity and decreased combination of Trx and TXNIP and p38 kinase activity.Conclusion These results suggested that TXNIP overexpression can induce severe apoptosis and injury in islet cell even they are cultured in normal glucose and normal lipid concentration conditions.The mechanism involved is that TXNIP can bind and inhibit Trx，thus impaired its antioxidative and antiapoptotic function，and then enhanced free radical induced injury and p38 kinase dependent cell apoptosis.Trx independent pathway may also participated since C247S mutated TXNIP cannot bind to and inhibit Trx and have no effect on p38 kinase activity induced cell apoptosis.

Thioredoxin； Thioredoxin-interacting protein； Islet cells； Apoptosis； Mutation

国家自然科学基金（项目编号：30800399）；山西省自然基金（项目编号：2014011049-12）;

山西省高等学校创新人才支持计划；山西省回国留学人员科研资助项目（项目编号：2009-46)

03000l 山西省太原市，山西医科大学生理学系

10.3969/j.issn.1672－5301.2014.12.019

R587.1

A

1672-5301（2014）12-1127－06

2014-10-11）