蝙蝠葛酚性碱对胃癌细胞SGC-7901 COX-2表达的影响

章 艳，苏 慧，苏云明

(黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040)

蝙蝠葛酚性碱(PAMD)是从北豆根中提取的活性成分.研究证实PAMD具有抗心律失常、抗脑缺血、抗心肌缺血和抗炎镇痛等[1-3]方面的药理作用.前期对蝙蝠葛酚性碱抗肿瘤作用进行研究，发现不同浓度蝙蝠葛酚性碱对SGC-7901细胞的增殖具有明显抑制作用，抑制作用与浓度呈正相关[4].本文旨在研究蝙蝠葛酚性碱对胃癌相关基因的影响，为临床上胃癌的治疗提供理论和实验依据.

1 实验材料

1.1 人胃癌细胞株SGC-7901

来源：凯基生物，货号：KG026.

1.2 实验药物

蝙蝠葛酚性碱(PAMD)：由黑龙江中医药大学药学院王栋教授提供.将 PAMD用一定量的DMSO溶解后用PBS定容，配制成质量浓度为400 μg/mL的溶液备用.注射用顺铂(DDP)：齐鲁医药有限公司；批准文号：国药准字H20023461；产品批号：WA2A1105005.将 DDP用生理盐水溶解解配，制成质量浓度为200 μg/mL溶液备用.空白对照组1为等体积PAMD溶剂.空白对照组2为生理盐水.

1.3 主要试剂

SYBR Premix Ex Taq 试剂盒：大连宝生物工程有限公司；PrimeScript RT试剂盒：大连宝生物工程有限公司；Trizol： Invitrogen公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计及合成：β-actin：上游5′-CGTGGACATCCGCAAAGAC-3′；下游5′-TGCATCCTGTCGGCAATG-3′，长度为84 bp；COX-2：上游5′-GCTCAGCCATACAGCAAATCC-3′；下游5′-TCCGGGTACAATCGCACTTAT-3′，长度为101 bp.

1.4 主要仪器

HDL型超净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；Z36HK型台式高速低温离心机：德国Hermle公司；iQ5实时荧光PCR仪：美国BIO-RAD公司；MyCyclerPCR仪：美国BIO-RAD公司.

2 实验方法

2.1 提取总RNA

取对数生长期的SGC-7901细胞，调节细胞浓度制成1×105个/mL的单细胞悬液，接种于培养瓶中；常规培养24 h后，更换含有10%药物的1640培养基，实验组PAMD终质量浓度为20、10、5 μg/mL，阳性对照组DDP为20 μg/mL，空白对照组1为等体积PAMD溶剂，空白对照组2为等体积生理盐水；培养24 h后用Trizol法提取总RNA.

2.2 总RNA反转录为cDNA

按PrimeScript RT试剂盒的组份配制RT-PCR反应液: PrimeScript RT Enzyme Mix I：0.5 μL；5×PrimeScript Buffer：2.0 μL；Oligo dT Primer：0.5 μL；Random 6 mers：0.5 μL； ddH2O：4.0 μL；RNA：2.5 μL；总计：10.0 μL.于37 ℃反转录15 min；再于85 ℃使反转录酶失活15 s.

2.3 Real-time PCR分析

按SYBR Premix Ex Taq 试剂盒的组份配制Real-time PCR反应液：SYBR Premix Ex Taq：12. 5μL；Real-time up：0.5 μL；Real-time down：0.5 μL；ddH2O：10.5 μL；DNA模板：1.0 μL；总计：25.0 μL.95 ℃预变性10 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s 扩增40个循环.记录样品Ct值，应用2-△△Ct法进行数据处理.

2.4 统计学分析

3 实验结果

实验结果表明，PAMD(20)、PAMD (10)、PAMD (5)组同空白1组比较COX-2 mRNA表达明显降低，且PAMD(20)组差异具有统计学意义(P<0.01)，DDP(20)组与空白2组比较COX-2 mRNA表达也明显降低，差异具有统计学意义，(P<0.05).结果见表1，图1.COX-2 mRNA荧光定量PCR扩增曲线及溶解曲线见图2、3.

组别 剂量/(mg·kg-1)COX-2mRNA 表达 (2-△△CT)PAMD(20) 20 0.3503±0.2770∗∗PAMD(10) 10 0.6866±0.4114PAMD(5) 5 0.7521±0.3875DDP(20) 20 0.5628±0.3283Δ空白1 等体积1空白2 等体积1

注：**表示PAMD(20)组与空白1组对比P<0.01；Δ表示DDP (20)组与空白2组对比P<0.05

图1 PAMD对胃癌COX-2 mRNA表达的影响

图2 COX-2 mRNA Real-time PCR扩增曲线

图3 COX-2 mRNA Real-time PCR溶解曲线

4 结 语

COX是催化花生四烯酸产生前列腺素的限速酶.正常状态下COX-2活性很低，COX-2过度表达与消化系肿瘤发生、发展密切相关.COX-2能够促进细胞黏附，抑制细胞凋亡的发生，诱导肿瘤新生血管的形成，促进肿瘤侵袭和转移[5-6].本实验研究发现PAMD各剂量组均能下调胃癌细胞株SGC-7901 COX-2 mRNA的表达，其中高剂量PAMD(20)组下调COX-2的作用较为明显，与空白组对比有统计学差异，且优于阳性对照组.推测PAMD抗胃癌的作用机理可能与其抑制COX-2基因表达有关.

参考文献：

[1] 肖佳音, 苏云明, 关 利, 等. PAMD对缺血性脑损伤Bcl-2和Bax基因表达的作用[J].哈尔滨商业大学学报：自然科学版, 2008, 24(1): 16-19.

[2] 韩 华, 于晓瑾, 培 良, 等. 蝙蝠葛酚性碱对“血瘀”模型大鼠全血粘度及脑缺血大鼠脑血流量的影响[J]. 中医药学报, 2007, 35(3): 12-13.

[3] 苏云明, 苏 慧, 盛 波, 等. 蝙蝠葛酚性碱对实验性心肌缺血血流动力学的影响[J]. 中国药师, 2004, 7(2): 83-85.

[4] 张洪峰, 章 艳, 苏 慧. 蝙蝠葛酚性碱对胃癌细胞SGC-7901增殖作用的实验研究[J].实用肿瘤学杂志, 2013, 27(2): 116-119.

[5] ALI-FEHMI R, MORRIS R T, BANDYOPADHYAY S,etal. Expression of cyclooxygenase-2 in advanced stage ovarian serous carcinoma: correlation with tumor cell proliferation, apoptosis, angiogenesis, and survival [J].American Journal of Obstetrics and Gynecology, 2005, 192(3): 819 -825.

[6] TATSUGUCHI A, MATSUI K, SHINJI Y,etal. Cyclooxygenase-2 expression correlates with angiogenesis and apoptosis in gastric cancer tissue [J].Human Pathology, 2004, 35(4 ): 488 -495.