电子束辐照对黄连有效成分影响的研究

王 强，张玉宝，梁宏斌，斯琴图雅，蒋继成，张春静

(1.黑龙江省科学院 技术物理研究所，哈尔滨 150086；2.哈药集团世一堂制药厂，哈尔滨 150078)

植物性中药材的有效成分多被包裹在细胞壁内，目前采用的提取方式多为传统的溶剂提取法[1]，如煎煮法、回流法、浸渍法、渗漉法等，大多利用溶媒进入药材细胞内溶解或分散有效成分，并将其转变成浸出液，即有效成分的固-液扩散过程.这个过程包含浸润、渗透、溶解扩散、置换阶段，将有效成分由药材细胞内带入溶液中需要通过细胞壁这一屏障，因此提取效率较低.

电子束是由电子加速器产生并加速的高能粒子束.本文利用电子束辐照能够使细胞壁、纹孔膜等薄弱组织破裂的特性，对黄连药材进行提取前辐照预处理，使其细胞壁破裂，为在相同提取条件下，不改变药材的化学稳定性，提高有效成分的溶出率提供相应的药学研究资料，为中药提取预处理提供一种绿色环保，简单易操作的研究新路线.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

安捷伦高效液相色谱仪(Agilent1100型)，电子天平(XS105型)，超声波提取器(GT-350W 型)，循环水式多用真空泵(SHB-Ⅲ型)，实验室pH计(PHSJ-4)，盐酸小檗碱，甲醇，磷酸，盐酸，磷酸二氢钾，乙腈，十二烷基硫酸钠(SDS)，其中十二烷基硫酸钠(SDS)为化学纯，乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯.

1.2 电子束辐照

称取黄连药材，粉碎后过二号筛，药用PE封口袋封装，每袋10 g，厚度0.3 cm，分别以剂量2、10、20、30、40、50、100、150 kGy剂量进行辐照，电子束能量为1 MeV，剂量率为0.67 kGy/s.

1.3 黄连药材有效成分溶出率检测

依据《中国药典》2010年版一部及其附录对辐照前后黄连药材进行有效成分溶出率检测[2]，并将检测结果进行统计学分析.

1.4 绘制指纹图谱

色谱条件Alltima-C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相为乙腈-50 mmol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH值为3.0)(50∶50)，内含浓度为12.5 mmol/L 的SDS；检测波长345 nm；流速1 mL/min；柱温为室温；进样量10 μL；理论板数按盐酸小檗碱计约为1.8×104.

对照品溶液：取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mg含90.5 μg的溶液，即得.

供试品溶液：精密称取不同批次黄连药材粉末，具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(100∶1)的混合溶液50 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得[3].根据黄连化学成分的文献报道[4]，并结合对照品进行分析，确定黄连药材HPLC图谱中各主要色谱峰，如图1.

峰2—5-OH小檗碱；峰3—非洲防己碱；峰4—药根碱；峰5—表小檗碱；峰 6—黄连碱；峰7—巴马汀峰8—小檗碱

2 实验分析

2.1 黄连有效成分溶出率分析

采用《中国药典》2010年版一部黄连项下检测方法测定黄连有效成分，测定结果及统计学分析见表1～5，有效成分溶出率变化情况见表6.

表1 辐照前后黄连药材有效成分测定结果(n=3)

表2 辐照后小檗碱溶出率变化统计学分析

注：-为无统计意义，+为有统计意义(P<0.05)，*为有高度统计意义(P<0.01)

表3 辐照后表小檗碱溶出率变化统计学分析

注：-为无统计意义，+为有统计意义(P<0.05)，*为有高度统计意义(P<0.01)

表4 辐照后黄连碱溶出率变化统计学分析

注：-为无统计意义，+为有统计意义(P<0.05)，*为有高度统计意义(P<0.01)

表5 辐照后巴马汀溶出率变化统计学分析

注：-为无统计意义，+为有统计意义(P<0.05)，*为有高度统计意义(P<0.01)

表6 辐照后黄连药材有效成分溶出率变化情况

结果显示，有效成分溶出率RSD(%)均在2.0%以下，以2-50 kGy剂量电子束辐照黄连药材，小檗碱及巴马汀的溶出率均有显著变化(P<0.05)，其中40 kGy为最优辐照剂量，以此剂量辐照黄连，经检测，小檗碱的溶出率增加8.46%，巴马汀的溶出率增加9.68%.而随着辐照剂量的进一步增加，黄连中小檗碱及巴马汀溶出率的增幅逐渐变小.

2.2 黄连药材指纹图谱分析

取三组黄连药材平行样品进行40 kGy电子束辐照，并比对指纹图谱.未辐照平行样品标记为a、b、c，辐照样品标记为1、2、3.图2为辐照前后黄连药材指纹图谱，分析结果显示见表7，以40 kGy电子束辐照黄连药材，各样品指纹图谱相似度均在0.99以上，表明该剂量下辐照未影响黄连药材化学结构，亦无新物质生成，辐照后黄连药材化学结构稳定性良好.

图2 电子束辐照(40kGy)前后黄连药材指纹图谱分析报告(n=3)

样品a样品b样品c样品1样品2样品3对照指纹图谱样品a10.9960.9970.9970.9960.9960.999样品b0.99610.9960.9970.9970.9960.999样品c0.9970.99610.9970.99710.998样品10.9970.9970.99710.9970.9980.999样品20.9960.9970.9970.99710.9990.999样品30.9960.99610.9980.99910.998对照指纹图谱0.9990.9990.9980.9990.9990.9981

2.3 黄连药材扫描电镜对比分析

图3、4分别为辐照前后黄连药材扫描电镜显微图，辐照前黄连细胞壁完整无裂痕，辐照后黄连细胞壁出现多处破裂，如图4中箭头标记处，可见电子束辐照对黄连药材的细胞壁具有破坏作用，经40kGy剂量电子束辐照后细胞壁破裂，从而形成新的流体通道，能够提高有效成分的溶出率.

图3 电子束辐照前黄连药材显微图

图4 40kGy剂量电子束辐照后黄连药材显微图

3 结果与讨论

利用1MeV的电子束，以剂量率0.67kGy/s，2kGy～50kGy的剂量辐照黄连药材，对黄连的细胞壁具有破坏作用，且通过辐照前后指纹图谱的对比，显示电子束辐照未影响黄连药材化学结构，亦无新物质生成，辐照后黄连药材化学结构稳定性良好.经辐照的黄连药材细胞壁上形成的细胞间新的流体通道能够显著提高其有效成分小檗碱及巴马汀的溶出率，其中40kGy为最优辐照剂量，经此剂量辐照后，黄连药材中小檗碱的溶出率增加8.46%，巴马汀的溶出率增加9.68%.

实验过程中随着辐照剂量的逐步增大，小檗碱及巴马汀的溶出率增幅反而逐渐下降，初步分析，产生这种现象的原因可能是由于电子束辐照剂量的增大，随着辐照时间的增加，使产生的热量逐渐积聚，并未及时导出，热能使药材细胞轻度脱水，从而使作为流体形式溶出的有效成分流动性变差，最终造成溶出率增幅降低.

参考文献：

[1] 韩 磊,向云霞,徐 磊. 中药提取工艺研究概述[J].新疆中医药, 2011, 29(3): 82-85.

[2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(2010年版·一部) [M].北京: 中国医药科技出版社, 2010.

[3] 赵 杨, 靳风云, 廖 薇, 等. HPLC法测定990康泰宝血疗贴中盐酸小檗碱的含量[J]. 贵阳中医学院学报, 2007, 29(2): 71-72.

[4] LAN J, YANG S L, ZHENG Y Q,etal. Advances in studies on Coptis chinensis [J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2001, 52: 1139-1141.