白花蛇舌草对胶原诱导性关节炎大鼠的保护作用

顾夙，徐守宇

（1.河南省南阳市中心医院骨科，河南南阳473000；2.浙江中医药学院附属第三临床医学院骨科，浙江杭州310053）

白花蛇舌草对胶原诱导性关节炎大鼠的保护作用

顾夙1，徐守宇2

（1.河南省南阳市中心医院骨科，河南南阳473000；2.浙江中医药学院附属第三临床医学院骨科，浙江杭州310053）

目的探讨白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.，HD）对胶原诱导性关节炎大鼠（collagen-induced arthritis，CIA）的保护作用。方法60只雄性Wistar大鼠随机分为正常组（n＝10）和给药组（n＝50），给药组用于建立Wistar大鼠CIA模型，造模成功后再随机分为模型组，雷公藤组，白花蛇舌草低、中、高剂量组，每组各9只并给予相应药物处理。自造模后第14天开始，每周观察各给药组的关节炎指数，于第42天处死大鼠检测各组血清的IL-1β、TNF-α水平，对比各组大鼠滑膜组织膜联蛋白Ⅰ的表达情况。结果HD低剂量组在第35天及42天时，关节炎指数均显著低于模型组（P＜0.05）；HD高剂量组在第28、35及42天时，关节炎指数显著低于模型组（P＜0.05）；HD各剂量组、IL-1β、TNF-α水平均显著低于模型组，差异具有统计学意义（均P＜0.05）；HD各剂量组膜联蛋白Ⅰ的表达量显著高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论HD可降低细胞炎症因子IL-1β、TNF-α的水平，缓解胶原诱导性关节炎大鼠的炎症反应及骨质侵蚀，提示HD对胶原诱导性关节炎大鼠关节具有保护作用。

白花蛇舌草；胶原诱导性关节炎；大鼠；保护作用

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以侵蚀性关节滑膜炎为特征的慢性、全身性自身免疫疾病［1］，研究认为其发病机制与遗传因素、感染因素、免疫因素、内分泌因素等相关［2-3］。目前，RA尚无根治的方法，传统西医治疗RA药物有4大类：非甾体抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDS）、改善病情抗风湿药（disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs）、糖皮质激素和生物制剂（如TNF-α抑制剂等）［4-5］。上述药物主要改善症状、缓解病情，因不能根治疾病，并且有严重的胃肠道、肝肾功能损害等不良反应，难以推广使用。我国民间应用中药组方（如益气解毒化瘀汤、痹肿消汤等）对RA的治疗已有悠久的历史。现代实验研究表明组方中单味中药白花蛇舌草（Hedyotis diffusaWilld.，HD）具有与治疗RA相关的抗炎、抗氧化和调节免疫等作用［6］。为进一步探讨清热解毒药物白花蛇舌草对RA的治疗机理，本研究采用胶原诱导制作关节炎性Wistar大鼠模型（collagen-induced arthritis，CIA），观察HD抗风湿的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：雄性SPF级Wistar大鼠60只，体质量为（200±10）g，8周龄，购自内蒙古大学动物中心，实验动物质量合格证编号：SCXK（蒙）2012-0001。本实验遵循《实验动物保护条例》。

1.1.2 实验试剂：完全弗氏佐剂（美国SIGMA公司，批号070M8704）；不完全弗氏佐剂（美国SIGMA公司，批号050M873）；牛II型胶原（美国Chondrex公司，批号110374、120197）；白花蛇舌草片（天津市中药饮片厂，国药准字Z36020632）；雷公藤多甙片（黄石飞云制药有限公司，国药准字Z42021212）；大鼠TNF-αELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号G26030370）；大鼠IL-1βELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号G12030371）；β-actin（TA-09，北京中杉金桥公司）；全蛋白提取试剂盒（BSP003，上海生工生物工程有限责任公司）；Rabbit Anti-AnnexinⅠ（Abcam）；IRDye 800cw Goat Anti-Rabbit IgG（H＋L）（美国LICOR公司）。

1.1.3 实验仪器：Odyssey红外荧光扫描成像系统（美国LICOR公司）；TE77XP半干电转印系统（赛默飞世尔上海仪器有限公司）；1730R高速低温离心机（基因有限公司）；Multiskan Mk3酶标仪（PE公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组：60只雄性Wistar大鼠，购回适应性喂养2周后，按随机数字表法从60只大鼠中分出10只作为正常组，余下50只为给药组，用于进行CIA模型的复制。

1.2.2 CIA大鼠模型的建立：按Chondrex公司胶原诱导性（CIA）大鼠模型制备的说明书进行，具体方法：先将牛Ⅱ型胶原10 mg完全溶合于0.05 mol／L乙酸水5mL中，配制成2mg／mL的牛Ⅱ型胶原溶液，再将5 mL此溶液与5 mL完全弗氏佐剂（Freund's complete adjuvant，FCA）充分混匀，配制成1mg／mL的牛Ⅱ型胶原溶液，模型组每只大鼠尾根部皮下注射抗原0.2mL；于7 d后用5mL牛Ⅱ型胶原与5mL不完全弗氏佐剂（Freund's incomplete adjuvant，IFA）用同样方法配制成1 mg／mL牛Ⅱ型胶原溶液，以每只0.1mL于大鼠尾根部皮下注射再次免疫。正常组注射同样剂量的生理盐水。在初次免疫2周后，对动物模型进行全面评估，剔除模型复制不成功动物。成功复制的CIA模型大鼠45只，造模成功率为90%。把造模成功的大鼠随机分为模型组、雷公藤组、HD低剂量组、HD中剂量组及HD高剂量组，每组各9只。

1.2.3 白花蛇舌草剂量的确定：根据体表面积折算的等效剂量比值（详见《药理实验方法学》）［7］，70 kg成人，每天服用白花蛇舌草30 g，相当于大鼠灌胃6 g／（kg·d），再取该剂量的相差1倍的相邻剂量，即确定3个干预剂量3 g／（kg·d）、6 g／（kg·d）、12 g／（kg·d）。

1.2.4 给药方法：于注射免疫14 d后，正常组及模型组给予蒸馏水灌胃1mL／（只·天），雷公藤组给予6.3 mg／（kg·d）雷公藤，HD低、中、高3个治疗组灌服白花蛇舌草片，灌胃剂量分别：3 g／（kg·d）、6 g／（kg·d）、12 g／（kg·d），1次／天，时间固定在上午9∶00，连续灌胃42 d。

1.2.5 观察指标

①一般情况观察：精神状态、被毛、食欲和活动情况，大鼠体质量增长变化。

②关节炎指数（arthritis index，AI）测定：自造模后第14天开始给大鼠关节炎的发病情况计分。该积分法主要内容为5级积分。其中，无关节炎现象记0分；小拇趾关节部位出现红热肿痛现象记1分；趾关节和足跖部出现肿胀现象记2分；踝关节以下部位出现红肿胀痛记3分；踝关节及踝关节以下部位出现红肿胀痛者4分。最后积分为四肢关节评分总分之和［8］。

③血清IL-1β及TNF-α水平测定：实验至42d时，各组大鼠禁食12h后断头取血，离心取上清液，按ELISA试剂盒说明书步骤，检测各组血清中IL-1β及TNF-α水平。

④ 膜联蛋白Ⅰ表达检测：取已处死大鼠的滑膜组织，Westernblot法检测膜联蛋白Ⅰ的表达情况。方法如下：抽提滑膜蛋白，测浓度，每孔上样量50μg，10%SDS-PAGE电泳，电压100 V；转膜，电流18mA，时间40min；一抗浓度1∶500，4℃摇床孵育过夜；二抗浓度1∶5000，室温避光摇床孵育1 h；红外荧光扫描成像系统（Odyssey）成像，运用仪器自带软件对结果进行半定量分析。

1.3 统计学方法 数据采用SPSS 17.0软件包进行统计学处理。正态计量资料以“±s”表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各给药组大鼠AI变化情况 HD低剂量组在第35天及42天时，关节炎指数均显著低于模型组（P＜0.05）；HD高剂量组在第28、35及42天时，关节炎指数显著低于模型组（P＜0.05，见表1）。

表1 各给药组大鼠关节炎指数（AI）比较（分）Tab.1 Comparison of the arthritic index in each drug groups（score）

2.2 各组大鼠血清IL-1β和TNF-α水平比较 42 d时，模型组、HD各剂量组IL-1β、TNF-α水平显著高于正常组（P＜0.05）；高、中、低剂量组IL-1β、TNF-α水平显著低于模型组（P＜0.05）；其中高剂量组的降低程度显著优于中、低剂量组（P＜0.05，见表2）。

表2 各组大鼠血清IL-1β和TNF-α水平比较（pg／mL）Tab.2 Comparison of the levels of IL-1βand TNF-αin each groups（pg／mL）

2.3 各组大鼠滑膜组织膜联蛋白Ⅰ的灰度值比较 42 d时，HD各剂量组膜联蛋白Ⅰ的灰度值显著低于模型组 （P＜0.05，见表3）。

表3 各组大鼠滑膜组织膜联蛋白Ⅰ的灰度值比较Tab.3 Comparison of the gray value of AnnexinⅠin synovial tissues of rats in each groups

3 讨论

白花蛇舌草为痹肿消汤中的君药之一，是临床上常用清热解毒药。其药理活性、化学成分及质量控制等方面的研究已有文献基础［9］：白花蛇舌草具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、调节免疫、保肝利胆等生物活性；化合物组成包括黄酮类、葸醌类、萜类、甾醇类、多糖类和酚酸类等。

目前，已有白花蛇舌草治疗RA相关机制的研究，主要通过调节免疫，下调炎症因子水平，抑制血管新生等方面起作用。张良等［10］研究发现白花蛇舌草对RA患者体外滑膜细胞的增殖有抑制作用。王瑞等［6］研究发现白花蛇舌草能通过抑制肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）缓解胶原诱导性（CIA）大鼠症状、控制炎症。顾士栋等［11］研究发现白花蛇舌草能够清除氧化损伤后细胞内过多的活性氧（ROS），而减轻荷瘤小鼠正常器官氧化损伤。

本研究根据Trentham等［15］提出的Ⅱ型胶原可产生抗原效应而造成组织免疫性损伤理论，应用Ⅱ型胶原建立大鼠胶原诱导性关节炎（CIA）模型。该模型特征与人类RA非常相似，是目前国内外研究类风湿性关节炎最优选的动物模型。研究结果显示，CIA大鼠经HD治疗28d后饮食、活动有所增强，毛发较模型组有光泽，关节炎指数与模型组比较有明显差异；血清中IL-1β、TNF-α含量，较模型组明显下降，且具有一定的剂量依赖性，说明HD可减轻CIA大鼠踝关节肿胀，降低炎性细胞因子IL-1β、TNF-α的水平。可能原因在于白花蛇舌草通过下调IL-1β、TNF-α水平，抑制黏附分子、血管内皮生长因子及其他炎症因子的产生，促进骨胶原合成，减少金属蛋白酶的表达及活性，而起到减轻关节炎症反应、骨质侵蚀和减少血管翳形成的作用［12-16］。这与王瑞等［6］研究结果相一致。同时研究发现，HD各剂量组膜联蛋白Ⅰ的表达水平明显高于正常组与模型组，说明白花蛇舌草可明显上调膜联蛋白Ⅰ的表达。可能原因在于膜联蛋白Ⅰ作为抗炎反应的调控因子，在HD的作用下，其生成量增多，直接占据嗜中性粒细胞表面受体或抑制单核细胞、巨噬细胞分泌白细胞介素和血浆肿瘤坏死因子，进而抑制炎症细胞黏附、渗出及浸润［17-19］。

综上所述，HD可降低细胞炎症因子IL-1β、TNF-α的水平，缓解胶原诱导性关节炎大鼠的炎症反应，提示HD对胶原诱导性关节炎大鼠关节具有保护作用。但是由于中药化学成分的复杂性使得中药难以向世界推广，得到国际认可，因此未来提取HD中单一有效成分进行研究是必要的。同时这些提取的化学成分，是否为HD口服后在体内可吸收成分，是否为HD治疗RA疗效的物质基础，需要利用生物药理分析方法进行实验研究来探究。

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（编校：王冬梅，吴茜）

Protective effect of Hedyotis diffusa Willd.on collagen-induced arthritismodel rat

GU Su1，XU Shou-yu2

（1.Department of Orthopaedic，Nanyang Municipal Central Hospital，Nanyang 473000，China；2.Department of Orthopaedic，The Third Affiliated Clinical Medical School of Zhejiang Traditional Chinese Medicine College，Hangzhou 310053，China）

ObjectiveTo explore the protective effect of Hedyotis diffusa Willd.on collagen-induced arthritis ratmodel.Methods60 maleWistar ratswere randomly divided into normal controlgroup（n＝10）and drug group（n＝50），the drug group were used to induced CIAmodel ofWistar rats，then were random ly divided into CIAmodel group，tripterygium group，low-dose HD group，medium-dose HD group，high-dose HD group，with 9 rats in each group，and were treated with homologous drugs.Since the14th day after induced，the arthritic index of all rats atdifferent time pointswere observed and measured.At42th day，all ratswere killed tomeasure the changes of serum cytokine levels including IL-1β，TNF-αlevel，and the gray value of AnnexinⅠin synovial tissues of rats in each group were compared.ResultsThe arthritic index，in HD low dose group at 35thand 42th day were significantly lower than that inmodel group，and in HD high dose group at28th，35thand 42th day were significantly lower than those in model group，and the differences were statistically significant（P＜0.05）.The levels of IL-1βand TNF-αin all HD dose groups were significantly lower than that in model group，and the differenceswere statistically significant（P＜0.05）.The expression of AnnexinⅠin synovial tissues of rats in all HD dose groups were significantly higher than that inmodel group，the differenceswere statistically significant（P＜0.05）.ConclusionHD could reduce the levels of cytokines（IL-1β，TNF-α），and alleviate the inflammatory response and bone erosion in CIA model.It is suggested that Hedyotis diffusa Willd.has the protective effect on collagen-induced arthritis rat.

Hedyotis diffusa Willd；collagen-induced arthritis；rat；protective effect

R32

A

1005－1678（2014）09－0064－04

2011年浙江省医药卫生计划（2011KYA116）

顾夙，男，本科，主治医师，研究方向：骨关节，E-mail：qch1821460065＠163.com。