NF-κB p50、NF-κB p65在甲状腺癌中的表达及意义

秦阳，王玲，吕晓娟

（1.沈阳医学院附属中心医院普外科，辽宁沈阳110024；2.沈阳市儿童医院医保科，辽宁沈阳110032；3.沈阳医学院附属中心医院儿科，辽宁沈阳110024）

NF-κB p50、NF-κB p65在甲状腺癌中的表达及意义

秦阳1，王玲2，吕晓娟3

（1.沈阳医学院附属中心医院普外科，辽宁沈阳110024；2.沈阳市儿童医院医保科，辽宁沈阳110032；3.沈阳医学院附属中心医院儿科，辽宁沈阳110024）

目的探讨NF-κB p50、NF-κB p65蛋白在甲状腺癌、甲状腺腺瘤、结节性甲状腺肿、正常甲状腺组织中的表达及二者与甲状腺癌的浸润、转移的关系。方法采用免疫组织化学染色法检测NF-κB p50和NF-κB p65蛋白在甲状腺癌组（60例乳头状癌、20例滤泡癌和20例髓样癌）及非甲状腺癌组（30例健康者、30例甲状腺腺瘤、30例结节性甲状腺肿）的甲状腺组织的表达，并检测NF-κB p50和NF-κB p65蛋白的表达的相关性。结果NF-κB p50蛋白在甲状腺癌、甲状腺腺瘤、结节性甲状腺肿及健康者甲状腺组织中的阳性率分别为73.00%、30.00%、33.33%及6.67%。NF-κB p50蛋白在甲状腺非癌组织的阳性率明显低于癌组织。NF-κB p65蛋白在甲状腺癌、甲状腺腺瘤、结节性甲状腺肿及健康者甲状腺组织中的阳性率分别为74.00%、36.67%、40.00%及10.00%。NF-κB p65蛋白在甲状腺非癌组织的阳性率明显低于癌组织。NF-κB p50蛋白在肿瘤直径≥1.0 cm组及＜1.0 cm组的阳性率分别为79.41%和56.25%，差异均有统计学意义（P＜0.05）；NF-κB p65蛋白在肿瘤直径≥1.0 cm组及＜1.0 cm组阳性率分别为94.12%和81.25%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。NF-κB p50蛋白和NF-κB p65蛋白在淋巴结转移组的阳性率分别为85.19%和87.04%；在无淋巴结转移组的阳性率分别为56.52%%和69.57%。差异均有统计学意义（P＜0.05）。NF-κB p50蛋白和NF-κB p65蛋白的表达呈正相关关系（r＝0.712，P＜0.05）。结论NF-κB p50蛋白和NF-κB p65蛋白参与甲状腺癌的表达，并于甲状腺癌的发生、发展过程中发挥着重要的协同作用。

甲状腺癌；NF-κB p50、NF-κB p65；免疫组化

甲状腺癌是内分泌系统最为常见的恶性肿瘤，也是近年来普外科中的常见病，发病率呈逐年增高的趋势［1-2］。甲状腺癌的病理类型有4种，分别为乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）、滤泡癌（follicular thyroid carcinoma，FTC）、未分化型癌（undifferentiated thyroid carcinoma，UTC）和髓样癌（medullary thyroid carcinoma，MTC），且甲状腺癌以乳头状癌在临床上较为多见［3-4］。目前对于甲状腺癌的诊断方式较多，但是由于其形态不典型等原因而存在一定的误诊或漏诊，因此应用分子生物学辅助诊断技术可以为其诊断和评估提供可靠的依据。NF-κB为一种蛋白因子，有研究表明［5-6］，NF-κB可通过持续活化而促进肿瘤细胞的增殖，降低其凋亡速度，上调血管内皮生长因子而促进血管新生，诱导基质金属蛋白酶的表达，并提高肿瘤细胞的浸润和转移能力，因此NF-κB参与了肿瘤的发生、发展等多个环节。NF-κB p50、NF-κB p65参与了多种癌细胞的表达，且发挥着重要作用。故本实验联合检测NF-κB p50、NF-κB p65在甲状腺癌中的表达，为甲状腺癌的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2010年2月～2014年2月沈阳医学院附属中心医院进行手术切除的甲状腺组织的新鲜标本190例，其中甲状腺癌标本100例，包括60例乳头状癌、20例滤泡癌和20例髓样癌，另取30例健康者的甲状腺组织，30例甲状腺腺瘤患者的甲状腺腺瘤组织和30例结节性甲状腺肿患者的结节性甲状腺肿组织。纳入标准：全部甲状腺患者均经确诊，无其他严重的脏器类疾病，且所有患者手术前3周内无任何放疗治疗。在100例甲状腺癌标本中，男35例，女65例，年龄为15～78岁，平均年龄为（45.3±15.0）岁，有淋巴结转移者54例，无淋巴结转移者46例，肿瘤直径≥1.0 cm者68例，肿瘤直径＜1.0 cm者32例。本实验获得患者知情同意，并且得到伦理委员会批准。

1.2 主要仪器与试剂 电热手提式压力蒸汽灭菌器（上海隆拓仪器设备有限公司），干燥箱（上海维菱科学仪器有限公司），电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），电子分析天平（北京京科瑞达科技有限公司），Olympus BH-2显微镜（日本Olympus公司），显微照相仪（日本Olympus公司），超纯水系统（德国赛多利斯集团）；兔抗人NF-κB p50克隆抗体（上海田源生物技术销售部），兔抗人NF-κB p65多克隆抗体（上海田源生物技术销售部），免疫组化染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），浓缩型DAB试剂盒（上海信誉科技有限公司），其余试剂均购自天津化学试剂三厂。

1.3 免疫组化染色 将本次实验使用的所有标本组织离体后进行固定，乙醇梯度脱水并以石蜡包埋，冷冻后切成4μm的组织切片，加热切片2 h后放入4℃的冰箱中保存。取出切片进行苏木精-伊红染色后严格按照免疫组织化学SP染色法的操作步骤进行免疫组织化学染色，以测得NF-κB p50，NF-κB p65蛋白在甲状腺癌及非癌组织中的表达。对照组为NF-κB p50、NF-κB p65阳性表达的乳腺癌切片，且染色结果均为阳性，以含0.05%吐温-20的pH 7.4的磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性空白对照，且其染色结果均为阴性。

1.4 观察指标 NF-κB p50，NF-κB p65的蛋白质阳性信号主要表现在细胞质和细胞核中，多为棕黄色颗粒，参考相关文献［7-9］确定本次实验的免疫组织化学染色结果判断标准，显微镜下以400×观察，对于着色细胞数评定：每观察100个细胞中，着色细胞＜5个，为0分；着色细胞为5～25个，为1分；着色细胞26～50个，为2分；着色细胞＞50个，为3分。对于细胞质或细胞核的评定：无色或稍微着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色或深黄色为2分，棕褐色或褐色为3分。将着色细胞数的评分与细胞质（核）的评分的乘积定为每组染色的综合评分，0～1分为阴性，2～3分为弱阳性，4～6分为阳性，＞6分为强阳性。

1.5 统计学方法 釆用SPSS17.0统计软件对本次实验数据进行分析，样本率的比较采用卡方检验，各因素间的相关性分析应用Spearman等级相关分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NF-κB p50、NF-κB p65蛋白的表达 NF-κB p50蛋白在100例甲状腺癌组织的阳性率为73.00%，呈高表达现象，在30例甲状腺腺瘤患者的甲状腺腺瘤组织和30例结节性甲状腺肿患者的结节性甲状腺肿组织的阳性率分别为30.00%和33.33%，呈低表达现象。而在30例健康者的甲状腺组织的阳性率为6.67%，呈极低表达现象。NF-κB p50蛋白在甲状腺非癌组织的阳性率显著低于癌组织（见表1）。

表1 NF-κB p50蛋白在4种组织中的表达情况Tab.1 Expression of NF-κB p50 protein in the case of the four tissues

NF-κB p65蛋白在100例甲状腺癌组织的阳性率为74.00%，同样呈高表达现象，在30例结节性甲状腺肿患者的结节性甲状腺肿组织和30例甲状腺腺瘤患者的甲状腺腺瘤组织的阳性率分别为36.67%和40.00%，表达率相对较低。而在30例健康者的甲状腺组织的阳性率为10.00%，同样为极低表达现象。NF-κB p65蛋白在甲状腺非癌组织的阳性率显著低于癌组织（见表2）。

表2 NF-κB p65蛋白在4种组织中的表达情况Tab.2 Expression of NF-κB p65 protein in the case of the four tissues

2.2 NF-κB p50、NF-κB p65蛋白在不同甲状腺癌病理参数中的表达 以患者肿瘤直径的长度和淋巴结转移与否进行分组，比较NF-κB p50、NF-κB p65蛋白表达在各组的阳性率表达情况，经χ2检验，NF-κB p50蛋白在肿瘤直径≥1.0 cm组和肿瘤直径＜1.0 cm组阳性率分别为79.41%和56.25%，差异具有统计学意义（P＜0.05），NF-κB p50蛋白在淋巴结转移组的阳性率为85.19%，在无淋巴结转移组的阳性率为56.52%，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。NF-κB p65蛋白在肿瘤直径≥1.0 cm组和肿瘤直径＜1.0 cm组阳性率分别为94.12%和81.25%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。NF-κB p65蛋白在淋巴结转移组的阳性率为87.04%，在无淋巴结转移组的阳性率为69.57%，差异均具有统计学意义（P＜0.05，见表4）。

表3 NF-κB p50蛋白在不同甲状腺癌病理参数中的表达Tab.3 Expression of NF-κB p50 proteins in different pathological parameters of thyroid cancer

表4 NF-κB p65蛋白在不同甲状腺癌病理参数中的表达Tab.4 Expression of NF-κB p65 proteins in different pathological parameters of thyroid cancer

2.3 NF-κB p50、NF-κB p65蛋白表达的相关性 在甲状腺癌的阳性率表达中，NF-κB p50蛋白阳性表达有73例，NF-κB p65蛋白阳性表达有74例，2者在甲状腺癌的阳性表达中的符合率为95.65%（73／74）；NF-κB p50蛋白阴性表达有27例，NF-κB p65蛋白阳性表达有26例，2者在甲状腺癌的阴性表达中的符合率为92.30%（26／27）；经spearman等级相关分析，NF-κB p50蛋白和NF-κB p65蛋白的表达呈正相关关系（r＝0.712，P＜0.05）。

3 讨论

NF-κB是一种存在于真核细胞中的重要的核转录因子，它不仅参与DNA的转录和启动，还与免疫炎症反应密切相关，是人体正常生命活动中的必要因子。研究表明［10-12］，NF-κB与人体的恶性肿瘤如食管癌、胰腺癌、胃癌、肝癌等多种癌症密切相关。NF-κB不仅可以促进肿瘤细胞的增殖与分化，还在肿瘤血管的生成中起到促进作用。在人体内，p50和p65是NF-κB家族中最为重要的两个因子，且2者多以二聚体的形式存在于激活后的细胞质或细胞核中，当机体免疫应答异常时，NF-κB不能及时恢复到原有的状态而停留在细胞核中，从而改变了机体的正常应答信号而致使细胞癌变。

在本次实验中，采用免疫组化法检测了NF-κB p50蛋白在100例甲状腺癌组织、30例甲状腺腺瘤患者的甲状腺腺瘤组织、30例结节性甲状腺肿患者的结节性甲状腺肿组织和30例健康者的甲状腺组织中的阳性率表达情况，结果显示NF-κB p50蛋白的阳性率分别为73.00%、30.00%、33.33%和6.67%，NF-κB p50蛋白在甲状腺非癌组织的表达率显著低于癌组织。这与其他学者［11-14］在肝癌、胃癌和腺癌中的检测结果类似，这就提示NF-κB p50蛋白的高表达与甲状腺癌密切相关。分析其作用机制可能为NF-κB控制着凋亡细胞因子的表达，从而诱导其相关因子的生成抑制凋亡，此外，NF-KB也与TNF-α存在着正反馈调节的关系，故其可以致使细胞调节失控从而诱发癌变。

同法检测了NF-κB p65蛋白在100例甲状腺癌组织、30例结节性甲状腺肿患者的结节性甲状腺肿组织、30例甲状腺腺瘤患者的甲状腺腺瘤组织和30例健康者的甲状腺组织中的阳性率分别为74.00%、36.67%、40.00%和10.00%，NF-κB p65蛋白在甲状腺非癌组织显著低于癌组织。本次实验结果与Sasaki N［15］等在40例非小细胞肺癌患者的肿瘤组织切片中的检测结果一致，提示NF-κB p65蛋白高表达对甲状腺良恶性病变的鉴别与检测存在着一定临床意义，但需要进行大样本的研究与分析。

在甲状腺癌的表达中，NF-κB p50蛋白和NF-κB p65蛋白在阳性表达中的符合率为95.65%（73／74），在阴性表达中的符合率为92.30%（26／27），经spearman等级相关分析，NF-κB p50蛋白和NF-κB p65蛋白的表达呈正相关关系（r＝0.712，P＜0.05）。这就提示2种蛋白之间的协同关系同甲状腺癌症细胞的浸润和转移存在着密切关系。在本次研究的前提下，可以再通过进行Kaplan-Meier生存曲线，来分析这2种蛋白与甲状腺癌的预后之间的关系，为后续研究NF-κB p50蛋白和NF-κB p65蛋白在甲状腺癌预后的风险评估奠定基础并提供重要的参考数据。

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（编校：谭玲）

Expression and significance of NF-κB p50 and NF-κB p65 in thyroid cancer

QIN Yang1，WANG Ling2，LV Xiao-juan3

（1.Department of General Surgery，Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical University，Shenyang 110024，China；2.Department of Medicare，Children's Hospital of Shenyang，Shenyang 110032，China；3.Department of Pediatrics，Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical University，Shenyang 110024，China）

ObjectiveTo investigate the expression of NF-κB p50 and NF-κB p65 protein in thyroid cancer，thyroid adenoma，nodular goiter and normal thyroid tissues，and the role of NF-κB p50，NF-κB p65 protein in infiltration and metastasis of thyroid cancer.MethodsImmunohistochemical staining was used to detect the expression NF-κB p50 and NF-κB p65 protein in thyroid tissue in thyroid cancer group（60 cases of papillary carcinoma，20 cases of follicular carcinoma，20 cases ofmedullary carcinoma）and non-cancerous group（30 cases of healthy thyroid，30 cases of thyroid adenoma，30 cases of nodular goiter），and correlation of expression between NF-κB p50 and NF-κB p65 protein.ResultsIn thyroid tissues of 100 patients with thyroid cancer，the positive rate of NF-κB p50 protein expression was 73.00%；in thyroid tissues of 30 patients with thyroid adenoma and 30 patients with nodular goiter，the positive ratewere 30.00%and 33.33%respectively；in thyroid tissues of30 healthy people，the positive rate was6.67%，the positive rate of NF-κB p50 protein expression in thyroid non-cancerous tissueswas significantly lower than that of thyroid cancer tissue.In thyroid tissues of100 patientswith thyroid cancer，the positive rate of NF-κB p65 protein expression was74.00%；in thyroid tissues of30 patientswith thyroid adenoma and 30 patients with nodular goiter，the positive rate were 36.67%and 40.00%respectively；in thyroid tissues of 30 healthy people，the positive rate was 10.00%.The positive rate of NF-κB p65 protein expression in non-cancerous tissues was significantly lower than that of thyroid cancer tissue.In tumor diameter≥1.0 cm group and tumor diameter＜1.0 cm group，the positive rate of NF-κB p50 protein expression were 79.41%and 56.25% respectively，and the difference was statistically significant（P＜0.05）；in tumor diameter≥1.0 cm group and tumor diameter＜1.0 cm group，the positive rate of NF-κB p65 protein expression was 94.12%and 81.25%respectively，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.The positive rate of NF-κB p50 protein and NF-κB p65 protein in lymph nodemetastasis group were85.19%and 87.04%，respectively；the positive rate in the group without lymph node metastasis were 56.52%%and 69.57%，respectively.The differences were statistically significant（P＜0.05）.The correlation of expression between NF-κB p50 protein and pNF-κB p65 positive was positive（r＝0.712，P＜0.05）.Conclusion NF-κB p50 protein andNF-κB p65 protein are involved in the expression of thyroid cancer，and play an important synergetic role in the occurrence and development of thyroid cancer.

thyroid cancer；NF-κB p50，NF-κB p65；immunohistochemistry

R653

A

1005－1678（2014）08－0148－04

秦阳，男，硕士，副主任医生，研究方向：普外科，E-mail：qy15989350322＠163.com。