顺铂对子宫内膜异位症大鼠模型VEGF及TNF-α的影响

肖丽，李坤

（1.山东省交通医院妇产科，山东济南250031；2.山东省医学科学院附属医院妇产科，山东济南250031）

顺铂对子宫内膜异位症大鼠模型VEGF及TNF-α的影响

肖丽1，李坤2

（1.山东省交通医院妇产科，山东济南250031；2.山东省医学科学院附属医院妇产科，山东济南250031）

目的观察顺铂对子宫内膜异位症大鼠模型血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）以及肿瘤坏死因子-ɑ（tumor necrosis factor-ɑ，TNF-α）的影响。方法采用自体子宫移植法建立子宫内膜异位症大鼠模型，将行假手术的大鼠作为正常对照标准，将建模成功的大鼠随机分为模型组、治疗组与对照组，观察异位病灶的形态特点，在光镜下分析治疗组治疗前后的病理特点，检测不同方法处理后异位病灶腹腔液中VEGF、TNF-α的浓度变化。结果治疗组治疗后异位病灶的上皮细胞明显变薄，间质细胞和腺体明显减少，腺体样结构增大；模型组异位病灶腹腔液VEGF、TNF-α的浓度显著高于假手术组，且具有显著性差异（P＜0.05）；治疗组异位病灶腹腔液VEGF、TNF-α的浓度显著低于模型组，且有显著性差异（P＜0.05）。结论子宫内膜异位症大鼠注射顺铂后，异位病灶腹腔液中VEGF、TNF-α的浓度明显降低，异位病灶中炎症细胞被抑制生长，异位病灶腹腔的微环境得到改善。

顺铂；子宫内膜异位症；大鼠模型；VEGF；TNF-α

子宫内膜异位症（endometriosis，EMT），又称异位症，指的是有生长能力的子宫内膜组织在子宫内膜异位的部位种植和生长，是妇科常见的良性病变和多发病［1］。EMT主要的临床症状包括继发性痛经、盆腔炎、盆腔包块、月经失调、不孕症等［2］。EMT具有类似恶性肿瘤侵袭、转移等生物学行为，严重威胁女性的生殖和健康。近年来，EMT的发病率呈逐年增长的趋势［3］。而目前对该病的治疗尚无金标准［4］。本研究通过建立SD大鼠EMT模型，分组比较，观察顺铂对EMT模型大鼠腹腔液中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 10周龄SD（Sprague-Dawley）大鼠，雌性，性成熟，未交配，清洁级，体质量230～300 g。饲养环境：温度20℃～24℃，湿度40%～60%，自然饲养，SPF级环境，12 h明暗交替。由河北省实验动物中心提供。本实验遵循《实验动物保护条例》。

1.2 仪器和试剂 顺铂注射液（南京制药厂有限公司），普朗DNM-9602酶标仪（上海圣科仪器设备有限公司提供），VEDF免疫组化及蛋白印迹试剂盒（Santa Cruz），TNF-α检测试剂盒（上海威奥生物科技有限公司），高速台式离心机GT10-1（北京时代北利离心机有限公司），THZ-82A型气浴恒温振荡器（江苏省金坛市环宇科学仪器厂）。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型的建立 实验大鼠经适应性喂养1周，于最后2天，每天给予大鼠肌肉注射苯甲酸雌二醇0.1mg／kg观察动情周期。1周后行进行阴道脱落细胞涂片检测，选取2个以上连续正常动情周期的大鼠作为实验对象，随机将其分为模型组（40只）和假手术组（10只）。模型组建立EMS大鼠模型，采用自体移植法。手术时，首先注射2%戊巴比妥钠1mL／kg使大鼠完全麻醉，将其固定于操作板上，剪去腹部毛发，酒精消毒。切开腹部找到子宫，同时使左侧子宫暴露在外。分离附着于卵巢附近约1 cm处子宫肌壁的结缔组织和脂肪，用手术线结扎两端。剪下中间长约1 cm的子宫，放于盛有生理盐水的盘中，找到管状子宫腔并纵向剖开，使子宫内膜显露出来，切取子宫壁块，大小约4mm×4mm。在腹壁切口右侧腹肌与皮下筋膜层之间打隧道，使其能正好进入子宫壁块，将切好的子宫壁块平整地置入隧道底部，内膜面需紧贴腹肌，逐层连续缝合腹部切口，使切口封闭，最后缝合腹腔。假手术组按照前述方法切取子宫组织，弃用，关闭腹腔，剩余操作以上相同，作为正常对照。手术后，给予各大鼠腹腔注射青霉素16万U／kg，连续5 d。手术后第2天，为促进移植子宫内膜生长，给予各大鼠注射雌二醇0.1mg／kg，每4天1次，共3次。假手术组肌肉注射等量的生理盐水。正常饲养，待术后21 d，采用戊巴比妥钠使大鼠麻醉，固定于操作板上，切开腹腔，仔细观察异位内膜成膜情况。采用游标卡尺测量异位内膜长宽高度，计算其体积，如增大的体积大于8mm3，并伴集聚有大量液体，出现透明小囊状，则表示建模成功。

1.3.2 模型大鼠分组及给药 选取上述进行建模成功的大鼠30只（4只麻醉致未成活，6只未建模成功，建模成功率为75%），随机分为模型组、治疗组、对照组，每组各10只大鼠。对照组，给予0.9%氯化钠液10mL腹腔灌注；治疗组，给予顺铂注射液2mg／kg加蒸馏水2mL腹腔灌注；模型组、假手术组，不做任何处理；各组均常规饲养，需灌药的每天1次，连续灌药30 d。30 d后，禁食12 h，完全麻醉大鼠，切开腹腔，迅速剪取异位病灶处囊泡病灶组织，假手术组则切取子宫内膜组织，将切取下来的组织用高温灭酶铝箔纸密封包裹，置于－80℃环境中冻存，待测量异位病灶大小。吸取少量异位病灶腹腔液分别置于标记的无菌离心管中。离心机设置转数为3000 r／min，离心20min，取离心后管中上清液，置于－20℃速冻保存，待检测其VEGF和TNF-α的浓度。

1.3.3 实验指标及检测方法 采用双抗体夹心ELISA法检测，操作方法参照ELISA试剂盒说明书，得到吸光度OD值，再运用CVXPT 32软件包计算出浓度值，得到腹腔液VEGF和TNF-α的浓度；

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行实验数据分析，正态计量数据用“±s”表示，正态资料组间比较采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型组病灶观察 建模成功后的大鼠异位内膜体积增大，有大量液体聚集，出现隆起的小囊泡，囊泡有血管及结缔组织覆盖，且血管较丰富，清晰可见（见图1）。

图1 建模成功后的大鼠治疗前子宫内膜异位病灶Fig.1 Endometriosis lesions ofmodel rats before treatment

治疗前对治疗组异位病灶进行病理分析，如图所示，以异位内膜上出现子宫内膜组织的间质细胞或者上皮细胞作为模型的标准。异位内膜腔内含有炎细胞及分泌物。与假手术组大鼠子宫内膜相比，异位内膜的腔样结构，腔内面的上皮、固有膜和固有膜基质细胞，腺体样结构与之相似。治疗后治疗组大鼠子宫内膜异位病灶病理分析。如图所示，异位病灶的上皮细胞显著变薄，间质细胞和腺体显著减少，腺体样结构增大（见图2）。

图2 治疗前后治疗组大鼠子宫内膜异位病灶病理分析（HE，×10）Fig.2 Clinicopathologic analysis of endometriosis lesions ofmodel rats in treatment group before and after treatment（HE，×10）

2.2 腹腔液VECF和TNF-α浓度比较 模型组异位病灶腹腔液VEGF和TNF-α的浓度显著高于假手术组，且差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组异位病灶腹腔液VEGF和TNF-α的浓度与模型组对比，无明显差异性；治疗组异位病灶腹腔液VEGF和TNF-α的浓度显著低于模型组，且差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

表1 腹腔液VECF和TNF-α浓度比较Tab.1 The concentrations of VECF and TNF-αin peritoneal fluid

3 讨论

子宫内膜异位症是一种具有类似恶性肿瘤生长特性的妇科常见良性病变。研究显示，子宫内膜的异位生长需通过血管新生、粘附与侵袭完成［5-6］。VEGF具有促进血管新生的作用，EMT患者异位病灶腹腔液中VEGF mRNA表达显著高于正常妇女［7］，因此VEGF的含量与子宫内膜异位症的形成有重要关系［8］。此外，TNF-α与VEGF能协同促进病灶内膜新生血管的生长。EMT患者与非子宫内膜异位症患者相比，腹腔液中VEGF、TNF-α含量差别较大，故可作为子宫内膜异位症的诊断及治疗的靶点研究［9］。已知顺铂能干扰细胞DNA合成，促使内膜凋亡，从而抑制增生，对人体增生性组织有显著的抑制作用［10］。因此本文选取顺铂对子宫内膜异位症大鼠进行治疗，通过分析大鼠腹腔液中VEGF、TNF-α改变情况，评价顺铂的治疗效果。

本研究结果显示，采用自体移植法建立的EMT大鼠模型，腹腔液中VEGF及TNF-α水平升高，这与张名香等［11］及李春霞等［12］报道的子宫内膜异位症患者体内VEGF水平一致。注射顺铂后，内膜组织的上皮细胞变薄，间质细胞和腺体减少伴腺体样结构增大，说明顺铂抑制了细胞生长；顺铂能降低异位病灶腹腔液中VEGF及TNF-α浓度，因此能抑制异位病灶中炎症细胞生长。李嘉等［13］报道，采用顺铂腹腔灌注治疗子宫内膜异位症大鼠异位病灶后，病灶体积明显缩小，腹腔液VEGF与TNF-α浓度明显降低，该结论与本次研究结果相符。乔庆等［14］称，EMT大鼠腹腔液中TNF-α含量升高，顺铂腹腔灌洗可能通过降低腹腔液中TNF-α的含量，对EMT起到了一定治疗作用。此外，多项研究从子宫内膜异位症其他腹腔液标记物水平改变情况证实了顺铂对EMT的治疗作用。王靓等［15］称，顺铂腹腔灌洗能显著降低子宫内膜异位症大鼠腹腔液白细胞介素18（interleukin-18，IL-18）的含量，改善腹腔微环境来进一步抑制异位子宫内膜的种植、生长、转移和复发。

综上所述，顺铂可能通过降低VEGF及TNF-α的水平来抑制子宫内膜异位症异位病灶中血管新生，对临床上用于治疗EMT，减少血管增生和降低侵袭等生理过程有着重要研究意义。

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（编校：谭玲）

Effect of cisplatin on VEGF and TNF-αlevels in endometriosismodel rat

XIAO Li1，LIKun2

（1.Department of Obstetrics and Gynecology，Traffic Hospital of Shandong Province，Ji'nan 250031，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，Affiliated Hospital of Shandong Provincial Academy of Medical Sciences，Ji'nan 250031，China）

ObjectiveTo investigate the effect of cisplatin on vascular endothelial growth factor（VEGF）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）of uterus endometriosis ratmodel.MethodsAutologous transplantation of uterine was used to build uterus endometriosis ratmodel.The sham surgery rats were treated as normal control group，and themodeling successful ratswere randomly divided intomodel group，treatment group and control group.The ectopicmorphological characteristics of the lesion were observed，the pathological features under the lightmicroscope were analysed before and after treatment，and the concentration change of VEGF and TNF-αwere detected under different treatment of ectopic foci in peritoneal fluid.ResultsAfter treatment，the epithelial cells of ectopic lesion in treatment group were significantly thinner.The stromal cells and glandswere significantly reduced，and the glandular-like structurewere increased.The concentrations of VEGF and TNF-αin the peritoneal of ectopic focus in model group were significant higher than sham-operated group（P＜0.05）.The concentrations of VEGF and TNF-αin the peritoneal of ectopic focus in treatment group were significantly lower than model group（P＜0.05）.Conclusion After injection of cisplatin，the concentrations of VEGF and TNF-αin the peritoneal of ectopic focus of ratwith uterus endometriosis could be significant reduced.The growth of inflammatory cells in ectopic focus could be inhibited and the microenvironment of ectopic lesions abdominal cavity be improved.

cisplatin；uterine endometriosis；ratmodel；VEGF；TNF-α

R711

A

1005－1678（2014）08－0099－03

山东省自然科学基金课题项目（ZR2009CL027）；济南市科技局科技明星计划课题项目（20100118）；山东省医学科学院医学基金课题项目（201023）

肖丽，女，硕士，主治医师，研究方向：子宫内膜异位症发病机制及诊疗，E-mail：qch1821460022＠163.com。