六味地黄丸联合银杏叶片对2型糖尿病患者趋化因子fractalkine的影响

王艳萍，余江毅，殷汉，安晓飞，王晓来，王尧，孙子林

(1.东南大学附属中大医院 内分泌科，江苏 南京 210009； 2.江苏省中医院 内分泌科，江苏 南京 210029)

糖尿病慢性并发症是糖尿病患者致残、致死的主要原因，严重影响糖尿病患者的生活质量，并增加患者家庭和社会的经济负担，其发病机制复杂，且目前尚无有效的治疗方法。既往研究显示，六味地黄丸及银杏叶片等中药对糖尿病慢性并发症有良好的防治效果，且在临床上被广泛使用，但缺少随机对照试验(RCT)研究，而且其药理作用机制不明。因此,本研究旨在通过RCT观察六味地黄丸和银杏叶片对防治2型糖尿病(T2DM)慢性并发症的效果。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2008年6月至9月东南大学附属中大医院内分泌科门诊T2DM患者116例，完成研究93例。本研究方案经伦理委员会批准，并获得患者书面知情同意。

1.2 纳入标准

(1) 符合T2DM诊断标准；(2) 年龄30～70岁，性别不限；(3) 无明显的糖尿病并发症，或仅有轻度微血管并发症(尿白蛋白排泄量<300 mg·d-1);(4) 血压≤160/110 mmHg;(5) 体质量指数(BMI)≤25 kg·m-2;(6) 知情同意，志愿受试。

1.3 排除标准

(1) 不符合诊断标准和纳入标准;(2) 1型糖尿病(T1DM)和特殊类型糖尿病、妊娠糖尿病;(3) 糖尿病重危急症，如酮症酸中毒、糖尿病高渗状态；(4) 已有大血管并发症，如发生过心肌梗死、脑血管意外、下肢血管病变；(5) 具有严重的心、肝、肺、肾、血液或影响其生存的严重疾病，如肿瘤或艾滋病；(6) 妊娠期、哺乳期妇女；(7) 根据研究者的判断具有降低入组可能性或使入组复杂化的其他情况，如工作环境经常变动等易造成失访的情况；(8) 正在服用可能影响血脂等观察指标的其他药物；(9) 正在参加其他药物临床研究。

1.4 分组

(1) 病例数：按1∶1对照原则，中药组与对照组各58例，共116例。最后完成实验纳入统计分析中药组49例，对照组44例。(2) 随机分组方法：采用区组随机化方法。(3) 盲法设计：采用双盲设计，中药组为基础治疗加六味地黄丸和银杏叶片，对照组为基础治疗加安慰剂。二级设盲，第一级为各病例号所对应的组别(如A和B组)，第二级为两组所对应的处理(中药组和对照组)。(4) 治疗方案：两组均给予降糖、降压等基础治疗。中药组加用仲景牌六味地黄丸(河南省宛西制药股份有限公司)，口服，8粒·次-1，3次·d-1；银杏叶片(江苏扬子江药业集团)，口服，2片·次-1，3次·d-1。对照组加服相应的安慰剂。连续服药24个月，患者每1个月复诊1次。血糖、血压控制目标水平：空腹血糖(FBG)≤7.0 mmol·L-1，餐后2 h血糖(PBG)≤10.0 mmol·L-1，血压≤140/90 mmHg。为避免血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂(ARB)、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、调脂药、阿司匹林类药物对微量白蛋白排泄率及血脂等的影响，试验前3个月及试验期间禁服此类药物。

1.5 观察指标

包括两组干预前及干预24个月后体质量指数(BMI=体质量/身高2)、腰围(Wc)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、FBG、PBG、糖化血红蛋白(HbA1c)、血肌酐(Scr)、尿微量白蛋白(UmAlb)、尿肌酐(UCr)。血清学及尿液指标由东南大学附属中大医院检验科统一检测,颈动脉内膜中膜厚度(IMT)由东南大学附属中大医院B超室统一检测;踝肱比(ABI)由东南大学附属中大医院内分泌科足病专业护士统一检测。计算尿微量白蛋白/肌酐比值(ACR=UmAlb×8 840/UCr)和肾小球清除率[男：GFR=(140-年龄)×体质量/(0.818×Scr)；女：0.85×(140-年龄)×体质量/(0.818×Scr)][1]。ELISA法检测干预24个月后血清fractalkine(Lot 301156，R&D，USA)、CRP(Lot 78034031，Bender MedSystems GmbH，Austria)、MMP2(Lot 303216，R&D，USA)。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 两组患者干预前后临床资料比较

基线年龄、性别、病程、糖尿病家族史、冠心病家族史、吸烟史等两组间差异无统计学意义，提示两组资料均衡可比(表1)。干预前后，BMI、WC、SBP、DBP、FBG、PBG、TG、HDL、HbA1c、ACR在两组患者间差异无统计学意义。TC、LDL在两组患者间差异均有统计学意义，提示这种差异可能是入组时两组间患者的原始差异而导致，并不是药物作用效果。但是GFR在基线时中药组明显低于对照组，而中药干预24个月后，对照组GFR下降，中药组GFR上升，两组间差异无统计学意义。中药组IMT呈下降趋势，ABI没有明显变化。

表1两组患者临床资料比较

Tab1Metabolicparametersatthebaselineand24monthstreatmentofcontrol(n=44)andTCM(n=49)

指 标基线对照组(n=44)中药组(n=44)24个月后对照组(n=44)中药组(n=44)年龄/岁59.00(56.00,66.00)63.00(58.50,65.50)(男/女)/例26/1820/29病程/月54.50(24.25,100.75)72.00(24.50,107.50)糖尿病家族史(有/无)/例23/2125/24冠心病家族史(有/无)/例23/2240/9吸烟史(有/无)/例30/1440/9BMI/(kg·m-2)23.84±3.0023.34±2.6723.85±2.6823.80±3.17腰围/cm84.06±8.2683.24±7.9684.80±8.4983.44±8.38SBP/mmHg124.13±11.36123.12±14.82120.07±11.05123.12±14.82DBP/mmHg76.06±6.7175.14±7.8874.37±7.2272.80±7.39bc(FBG)/(mmol·L-1)6.86(6.18,8.08)7.09(6.41,7.90)6.40(5.70,7.40)a6.50(5.70,7.30)bc(PBG)/(mmol·L-1)10.26(8.08,12.81)9.85(8.15,13.14)9.75(7.80,11.62)8.70(7.28,11.00)bc(TC)/(mmol·L-1)4.52±0.914.94±1.06a4.43±0.835.01±0.86cc(TG(/(mmol·L-1)0.96(0.68,1.44)1.09(0.78,1.59)1.15(0.76,1.83)a1.08(0.79,1.92)c(HDL)/(mmol·L-1)1.28±0.301.33±0.321.19±0.31a1.33±0.40c(LDL)/(mmol·L-1)2.65±0.693.10±0.72a2.67±0.673.11±0.82cHbA1c/%7.20±1.817.23±1.156.54±1.16a6.74±0.93bρ(ACR)/(mg·g-1)11.38(6.55,17.59)14.28(8.52,28.47)8.58(6.68,15.35)12.70(7.54,20.71)c(Scr)/(mmol·L-1)74.22±20.7673.47±14.6979.07±12.0573.47±14.69GFR/(ml·min-1·1.73m-2)82.30(72.91,97.94)72.95(59.85,81.67)a77.85(62.01,91.72)a73.76(57.25,91.54)IMT/mm1.12±0.141.12±0.161.13±0.111.09±0.19ABI0.79±0.180.80±0.200.83±0.220.83±0.20

与基线对照组比较，aP<0.05;与基线中药组比较,bP<0.05;与24个月后对照组比较,cP<0.05

2.2 相关性分析

ACR与干预与否(r=-0.21，P=0.05)、GFR(r=-0.23，P=0.00)、TC(r=0.37，P=0.00)、LDL(r=0.28，P=0.01)、fractalkine(r=0.34，P=0.00)、CRP(r=0.43，P=0.00)有明显相关性；IMT与年龄(r=0.30，P=0.00)、病程(r=0.29，P=0.00)、CRP(r=0.20，P=0.04)呈正相关；ABI与相关变量未见相关性。

2.3 回归分析

分别将ACR、IMT、ABI取对数后为应变量(满足正态分布要求)，以ACR、IMT、ABI相关危险因素及保护性因素为自变量进行回归分析，最后进入ACR模型有意义的变量为分组情况(r=-2.04，P=0.05)、fractalkine(r=2.25，P=0.03)、CRP(r=2.22，P=0.03)，进入IMT模型有意义的变量为CRP(r=2.13，P=0.04)；ABI未见明显阳性结果。提示服用研究用药为糖尿病慢性并发症的保护性因素，fractalkine、CRP为其危险因素。

2.4 两组间炎症因子的比较

经中药联合治疗24个月后，对照组血清fractalkine由0.49(0.33，0.78)ng·ml-1上升至0.69(0.51，0.92)ng·ml-1(P>0.05)，中药组由0.66(0.32，0.79)ng·ml-1下降至0.55(0.35，0.69)ng·ml-1(P<0.05)(表2)。中药组CRP低于对照组[(0.73±0.59)vs(0.96±0.79)mg·L-1，P=0.19]，MMP2高于对照组[(186.66±72.68)vs(173.43±59.91)ng·ml-1，P=0.34]，但差异无统计学意义。

表2两组患者干预前后fractalkine的变化

Tab2Theeffectof24monthstreatmentinthecontrol(n=44)andTCMgroup(n=49)onfractalkine

组 别ρ(fractalkine)/(ng·ml-1)对照组(n=44)基线0.49(0.33,0.78)0.67±0.5924个月后0.69(0.51,0.92)0.78±0.43差值0.11±3.49治疗组(n=49)基线0.66(0.32,0.79)0.62±0.1624个月后0.55(0.35,0.69)a0.56±0.25差值-0.06±2.83a

与对照组比较,aP<0.05

3 讨 论

糖尿病慢性并发症病理机制复杂，临床上尚缺乏特异有效药物。与西药的单一作用靶点不同，中医中药可根据T2DM患者的临床表现辨证施治，在患者体内多系统、多靶点发挥疗效。本课题组前期实验[2-4]发现,六味地黄丸与银杏叶片能够有效减少糖尿病肾病患者尿微量白蛋白水平，可以延缓T2DM患者颈动脉内膜中膜的增厚，减少大血管并发症的发生。

六味地黄丸由熟地黄、山茱萸、干山药、泽泻、茯苓、丹皮六味药组成，以补肾阴为主，其药理研究已较全面深入，有降血糖、降血脂、调节免疫、抗衰老、抗肿瘤等作用，在中国、日本和其他亚太地区被作为糖尿病和肾脏疾病的保护性用药而广泛用于临床[5-6]。银杏叶片主要成分为银杏黄酮甙、银杏内甙和白果内甙等，具有抑制血小板聚集、降低血液黏度、清除氧自由基等作用，可以抑制胞外基质沉积及肾组织中核因子-κB(NF-κB)的活化，减少超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等的表达而控制过强的氧化应激和炎症反应[7-8]。据此我们推测,它们可能通过影响炎症通路发挥其糖尿病慢性并发症防治效应。

近年来，炎症反应在糖尿病慢性并发症发生机制中的作用引起了人们的广泛关注。越来越多的动物及临床试验证明,免疫炎症反应细胞、细胞因子、急性期反应蛋白及凝血因子等炎症反应因子在糖尿病慢性并发症中发挥重要作用。CRP是经典的炎症反应标志物，在T2DM患者中明显升高[9]，是糖尿病血管并发症的危险因素[10]。细胞因子尤其是趋化因子吸引单核巨噬细胞等进入肾小球系膜区和肾小管间质是始动糖尿病肾病的早期事件[11]。本课题组既往体外研究[12-13]提示,趋化因子fractalkine可通过与MMP2的交互作用增加促进单核巨噬细胞在肾小球系膜区浸润与聚集，增加胞外基质的沉积，促进糖尿病肾病的发生发展。

我们研究发现，fractalkine与ACR呈正相关，是糖尿病肾病的危险因素，经中药联合治疗24个月后，相较于对照组的上升趋势，治疗组血清fractalkine显著下降，但是MMP2在两组间没有差异。提示六味地黄丸联合银杏叶片治疗可以通过降低趋化因子fractalkine的血清含量，从而减少单核巨噬细胞在肾小球系膜区浸润与聚集进而减少胞外基质的沉积，延缓糖尿病肾病的进展。CRP与ACR、IMT呈正相关，是尿微量白蛋白、IMT增厚的危险因素。提示CRP与fractalkine参与了糖尿病慢性并发症的发生发展，与国内外研究结果[9,14-15]一致。

本研究尚存不足：(1) 样本量不足。本研究受国家十一五支撑计划支持，来源于一个多中心随机双盲对照研究，研究对象仅取自一个中心(东南大学附属中大医院)，故样本量有限。(2) 脱落病例数较高。由于研究用药为中药，有苦涩味，有中药气味，安慰剂只能做到形似，但是不能做到气味口味一致。部分患者能自行辨认所服用药物为安慰剂而要求退出实验。(3) 缺乏部分基线数据。检测的CRP、MMP2等炎症相关指标仅限于干预24个月后的血标本，仅有24个月后的横断面研究数据。因此对于炎症指标讨缺乏干预前后的对比情况。

4 结 论

本研究揭示了CRP、fractalkine等炎症相关因子为糖尿病慢性并发症的危险因素，显示六味地黄丸联合银杏叶片可以有效减少fractalkine的释放，抑制胞外基质沉积，从而为糖尿病慢性并发症的防治研究以及认识中药药理作用机制提供一个新思路。

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