人参皂甙Rg1对老龄脑缺血再灌注损伤大鼠脑功能的保护及谷氨酸、天冬氨酸含量的影响

周媛媛 李超彦 李 立

(漯河医学高等专科学校基础医学部，河南 漯河 462002)

人参皂甙(GS)是人参的主要药理活性成分之一，具有抗氧化、抗衰老和减轻神经功能损伤的作用，作为中药复方制剂的主要成分之一已应用于脑血管疾病的治疗〔1〕；但GS包含较多单体如Rb1、Rd、Re、Rg1、Rg3等，故对其单体药理活性的研究显得尤为重要〔2〕。目前缺血性脑血管病的实验研究中多以青年动物为对象，忽视了人类脑血管疾病中年龄增长因素的重要性，对探讨老年缺血性脑血管病病理生理特点及指导临床防治方面有一定的不足。本实验采用老龄脑缺血再灌注损伤(IRI)大鼠模型，研究GS单体Rg1对脑IRI大鼠脑功能的保护作用及谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)含量的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1材料 清洁级Wistar大鼠，雌雄不拘，15月龄48只，体重350～390 g，由郑州大学医学院实验动物中心提供(合格证号：20110020)；GS Rg1由上海同田生物技术有限公司提供(批号：10110619)，使用前用生理盐水按0.1ml/kg配成合适浓度后给药；血栓通注射液由雅安三九药业制药有限公司提供(批号：1011009)；MSE-25型高速冷冻离心机(上海科学仪器厂)，电子天平(梅特勒AL10401)，超低温冰箱(美国ThermoForma702)，Waters高效液相色谱仪(Waters公司)，721-分光光度计(上海第三分析仪器厂)。

1.2动物分组 大鼠适应性饲养1 w，自由饮食；随机分为假手术组、模型组、低剂量、中剂量、大剂量GS Rg1组及血栓通组，每组8只。术前5 d腹腔注射GS Rg1低、中、高剂量分别为10、20、40 mg/kg，血栓通注射液0.45 mg/kg，造模前0.5 h静脉给药1次，造模后4 h和10 h分别再进行腹腔注射给药。模型组及假手术组给以等量生理盐水腹腔注射。

1.3动物模型制备 参照Longa等〔3〕方法建立大鼠中动脉阻塞模型。大鼠10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉后，沿颈部正中切开，分离右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉；用丝线结扎右颈总及颈外动脉，在颈内动脉处预先打一松结；在右颈总动脉分叉处剪一V形缺口，将阻塞线由切口插入并轻推至颈内动脉处，结扎预置的松结；随后碘伏消毒，缝合皮肤。缺血2 h后，大鼠再次麻醉后，剪开切口，将阻塞线退出至颈内动脉颈段以实现缺血后再灌注，消毒及缝合皮肤。

1.4造模成功标准 取造模大鼠侧脑切片行2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色，变白色为模型成功。术后实验动物出现左侧眼睑下垂，眼球凹陷，不能完全伸展左侧前肢及行走时向左侧倾倒或转圈。符合上述标准且存活24 h者作为实验对象，立即进行行为学评分并取脑组织备用。

1.5行为学评分 按照Longa等〔3〕神经功能缺损评分法评分。0分，无神经损伤症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，向对侧转圈；3分，向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。神经功能缺损评分时间点同上。

1.6脑梗死范围测定 将造模后存活24 h大鼠，快速取出两侧大脑半球，冰冻20 min后于大脑中间取冠状切面脑组织切片，置于TTC中，15 min后以4%甲醛固定。以BI2000医学图像分析系统计算脑梗死面积百分比。

1.7病理学检查 大脑中间取冠状切面脑组织切片，4%甲醛固定，脱水，石蜡包埋后切片，行HE染色。光镜下观察组织病理学变化。

1.8脑组织匀浆制备 取剩余大脑半球颞叶，制成10%脑组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液置-20℃冰箱备用。以高效液相色谱法学进行Glu和Asp含量测定。

1.9统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1GS Rg1对大鼠脑梗死面积及神经行为学评分的影响 与假手术组比较，模型组行为学评分显著升高(P<0.01)，脑梗死面积显著增大(P<0.01)；与模型组比较，GS Rg1中、大剂量组及血栓通注射液组行为学评分显著降低(P<0.05)，脑梗死面积均显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 GS Rg1对大鼠脑梗死面积及行为学评分的影响

2.2GS Rg1对脑组织Glu、Asp含量的影响 与假手术组比较，IR 24 h后模型组Glu和Asp显著升高(P<0.01)，与模型组比较，GS Rg1中、大剂量组及血栓通组Asp含量明显降低(P<0.05)，GS Rg1中剂量组Glu含量明显降低(P<0.05)，GS Rg1大剂量组及血栓通组Glu含量明显降低(P<0.01)。见表2。

表2 GS Rg1对脑组织Glu、Asp含量的影响

2.3脑组织形态学改变 光镜下可见假手术组脑组织无明显缺血性病理改变，各类细胞胞质胞核界限清晰；模型组脑组织缺血再灌注区域可见神经元及神经胶质细胞出现肿胀变形，胞质胞核界限不清，部分胞核固缩、核膜模糊核仁不清或者消失，细胞间质疏松水肿、间隙变宽，可见少量炎症细胞浸润，呈现缺血性病理改变。各GS Rg1剂量组中随剂量增大可见脑组织IRI程度明显减轻，细胞核及细胞膜轮廓渐清晰，间质水肿减轻。血栓通组脑组织光镜变化可见类似于GS Rg1大剂量组的表现。

3 讨 论

脑IRI涉及极其复杂的病理生理过程，其中各个环节、各种影响因素间的相互作用尚未完全阐明〔4〕。目前研究显示缺血期间升高的Glu、Asp等兴奋性氨基酸的兴奋毒性在神经细胞损伤及引发的脑功能障碍中起重要而关键的作用，缺血时间愈长，脑间质Glu与Asp的峰值浓度愈高，神经病理学和神经功能学损伤愈严重〔5，6〕。因此检测IRI后脑组织Glu与Asp含量的变化，可从侧面反映IRI的损伤程度，而降低兴奋性氨基酸含量可能是改善IRI的一个有效治疗手段。

离体及在体研究表明人参具有滋补、抗疲劳、益智、抗癌等多方面作用；GS是人参的主要药理活性成分，研究表明其可通过调节细胞膜蛋白离子通道而发挥多种药理效应〔1,7〕；Rg1是GS的一种单体及主要活性成分之一，作为小分子亲脂性物质而易于通过血脑屏障，其对神经系统的保护作用及机制是目前研究的热点〔8，9〕。已有研究表明GS Rg1可降低颅脑损伤大鼠神经细胞的凋亡率达到脑保护作用〔10〕，通过抑制Bax表达，降低Bax/Bcl-2比值，从而减轻脑损伤；其效应可能与通过清除氧自由基，增加抗氧化反应而实现〔11〕；GS Rg1对海马损伤大鼠的学习记忆同样有促进作用，可能同样与其抗氧化作用相关〔12〕。随着年龄的增长，机体内氧化应激水平逐渐升高，GS Rg1的抗氧化能力可减轻其对脑组织及血管造成的损伤，但其对脑IRI后是否存在保护作用及其机制，目前尚未明确。

本研究表明兴奋性氨基酸参与了脑IRI和迟发性神经损伤的发生发展。本研究还表明GS Rg1能改善老龄大鼠脑IR引起的脑组织功能损伤，其机制可能与其降低脑组织中Glu及Asp含量有关，从而减轻或限制了Glu、Asp等兴奋性氨基酸的神经兴奋毒性。

4 参考文献

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10陈大庆，朱烈烈，李永领，等.人参皂甙Rgl对颅脑损伤模型大鼠神经细胞凋亡的影响〔J〕.实用医学杂志，2010；26(1)：30-1.

11周洪霞，张作风，张志勇，等.人参皂甙Rg1对大鼠肢体缺血再灌注后脑组织Bax和Bcl-2表达的影响〔J〕.解剖学杂志，2011；34(1)：55-7.

12陈志勇，杜天明，陈善成，等.人参皂甙Rg1对海马电损伤大鼠的学习记忆功能和海马神经细胞形态的影响〔J〕.南方医科大学学报，2011；31(6)：1039-42.