低分子肝素联合依那普利对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织结缔组织生长因子表达的影响

王琳娜 李强翔 杨山华

(河南省中医院肾内科，河南 郑州 450000)

肾小管间质损害是影响肾脏疾病进展和预后的重要因素，结缔组织生长因子(CTGF)作为转化生长因子β(TGF-β)的下游介质，有促进细胞增生和细胞外基质(ECM)合成的作用,细胞外基质的主要成分包括Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ型胶原和纤维黏连蛋白(FN)。单侧输尿管梗阻(UUO)模型是以进行性小管间质纤维化为特征的实验性肾病模型。血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)可延缓肾间质纤维化的发生发展,对此国内外有不同的报道〔1，2〕。低分子量肝素有抗凝、抗血栓和改善微循环的作用，并能减轻蛋白尿和延缓肾小球硬化。本实验通过低分子肝素和依那普利的联合治疗观察两者联合使用对肾间质纤维化大鼠肾组织CTGF表达和Ⅰ型胶原mRNA表达的影响，探讨两者联用抗肾间质纤维化机制。

1 材料和方法

1.1实验动物及分组 清洁级雄性SD大鼠40只,体质量180～220 g,由郑州大学实验动物学部提供。分成UUO模型组、依那普利组、低分子肝素组、低分子肝素+依那普利联合组各8只和假手术组(8只)。UUO模型的制备：10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉后,无菌手术操作打开腹腔,分离左输尿管,用4-0号线双重结扎并离断输尿管,分层缝合关闭腹腔;假手术组只分离输尿管后即关闭腹腔。每组大鼠于UUO后第14天处死,留取梗阻侧肾组织备用。依那普利组自术前24 h开始给予依那普利10 mg·kg-1·d-1灌胃,直至造模后第14天；低分子肝素组自术前24 h开始给以低分子肝素钙410 U/kg皮下注射，每天2次直至造模后第14天；联合组给予上述两种治疗联用；UUO模型组和假手术组只给同量生理盐水灌胃和生理盐水皮下注射。

1.2主要材料 马来酸依那普利购自江苏扬子江制药股份有限公司,低分子肝素钙购自葛兰素史克有限公司组织，总RNA提取试剂盒(RNeasyMini Kit试剂盒)购自美国Qiangen公司,逆转录试剂盒购自美国Promega公司,real-time PCR试剂盒(q-PCR Mixture)购自日本TaKaRa公司,荧光探针实时定量PCR仪(ABI 7900HT)购自美国Applied Biosystems公司,real-time PCR所用引物由上海生物工程有限公司合成,羊抗CTGF多克隆抗体购自美国Abcam公司，鼠抗β-actin单克隆抗体购自美国Sigma公司,二抗均购自美国Sigma公司,增强化学发光(ECL)显色液购自美国Pierce公司。

1.3观察指标及检测方法

1.3.1肾脏组织HE染色 肾组织以4%多聚甲醛固定,常规包埋、切片,做HE染色观察肾组织病理变化,每张标本低倍镜下单盲依序观察左上、右上、左下、右下、中间5个肾小管间质视野,依据肾小管上皮细胞空泡变性、肾小管扩张、肾小管萎缩、红细胞管型、蛋白管型、间质水肿、间质纤维化、间质炎性细胞浸润等8项指标来观察肾间质病理改变并进行肾小管间质损伤指数评分〔3〕。

1.3.2肾脏组织Masson染色 肾组织以4%多聚甲醛固定,常规包埋、切片,做Masson染色观察肾组织病理变化胶原的沉积,每例切片低倍镜下观察10个互不重叠肾小管间质视野，计算每例切片肾间质Masson染色阳性面积占整个视野百分比，以对肾间质胶原含量进行半定量分析〔4〕。计分如下：0分：无着色；1分：轻度<10%；2分：中度：11%～25%；3分：重度：26%～50%；4分：极重度：>50%。

1.3.3CTGF和Ⅰ型胶原的Real-time PCR检测

1.3.3.1组织总RNA的提取 依照Werbrock等〔5〕报道的方法,用RNeasyMini Kit试剂盒提取组织总RNA,抽提的总RNA用紫外分光光度计测OD值,比值在1.9～2.0之间,取3 μl RNA用1%琼脂糖凝胶电泳,可见5 S,18 S,28 S 3条清晰的RNA带,提示RNA无污染和降解。

1.3.3.2cDNA的合成 按O’Neill等〔6〕报道的方法,用逆转录试剂盒合成cDNA,再以此cDNA为模板进行Real-time PCR反应操作。Real-time PCR的引物序列如下:β-actin 上游5′-GGCCAACCGTGAAAAGATGA-3′,下游5′-GACCAGAGGCATACAGGGACAA-3′;CTGF上游5′-CCTGTGAAGCTGACCTAGAGGAAA-3′,下游5′-ACA-GAACTTAGCCCGGTAGGTCTT-3′；Ⅰ型胶原上游5′-TCAGGGGCGAAGGCAACAGT-3′，下游5′- TTGGGATGGAGGGAGTTTACACGA-3′。

1.3.3.3Real-time PCR检测 在ABI 7900型荧光定量PCR仪上进行扩增,96孔板加样,设计复孔和标准曲线,用Se-quence Detection System软件分析各检测样本的Ct值(达到一定荧光阈值的循环数),计算2-ΔΔCt评价CTGF在肾组织中的表达水平。

1.3.4肾组织CTGF蛋白的Western印法检测

1.3.4.1肾皮质总蛋白质的提取 取组织块100 mg加入组织总蛋白提取液1 ml匀浆,冰上裂解30 min,4 ℃ 12 000 r/min离心15 min,取上清,按Bio-rad蛋白定量试剂盒方法进行蛋白定量,取80 μl上清加5×变性缓冲液20 μl混匀,100 ℃下变性10 min。

1.3.4.2免疫印迹检测 灌制10%的分离胶和4%的堆积胶,取总蛋白100 μg行上样电泳,电泳结束后260 mA电转印90 min至PVDF膜。封闭液(5%牛奶)摇床上封闭2 h,加入羊抗CTGF多克隆抗体(1∶200),4℃摇床过夜。洗膜后再加相应的二抗,室温孵育1 h,加ECL液后显影、定影,以β-actin为内参照。将胶片扫描后,采用Quantity One软件分析各条带灰度值,将各目的条带灰度值除以同一标本内参照β-actin条带灰度值得到一比值,将该比值除以同一胶片上假手术组的比值作为该目的蛋白表达量的半定量结果。

1.4统计学处理 采用SPSS12.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1HE染色 假手术组肾脏未见明显病变,模型组UUO术后第14天,大体观肾皮质变薄,镜下见肾小管上皮细胞空泡变性及炎性细胞浸润,部分小管萎缩,远曲小管、集合管呈囊状扩张,部分近端小管保存尚好,间质可见成纤维细胞增殖和纤维化。低分子肝素治疗组术后第14天,炎性细胞浸润较模型组减轻,但肾小管上皮细胞变性、肾小管扩张及萎缩和间质纤维化程度与模型组相比无明显差别；依那普利组术后第14天,炎性细胞浸润明显减轻,肾小管上皮细胞空泡变性、肾小管扩张及萎缩及间质纤维化程度有所减轻；联合组术后第14天，炎性细胞浸润较模型组明显减轻,肾小管上皮细胞变性、肾小管扩张及萎缩和间质纤维化程度明显减轻，与模型组相比均有明显好转。对HE染色进行肾间质损伤指数评分。见表1。

表1 各组大鼠肾间质损伤指数评分±s，n=8)

2.2梗阻侧肾组织胶原相对面积 假手术组肾小球基底膜、肾小管基底膜、系膜基质染成绿色，肾间质无明显胶原纤维；模型组肾间质可见大量染成绿色的胶原纤维；低分子肝素组、依那普利组和联合组肾间质可见少量染成绿色的胶原纤维。对Masson染色进行肾间质胶原相对面积评分。见表1。

2.3Real-time PCR结果 UUO术后14 d,肾组织CTGF和Ⅰ型胶原mRNA的表达较模型组明显增多。经低分子肝素和依那普利治疗后,肾组织CTGF和Ⅰ型胶原mRNA的表达均较模型组有所减少(P<0.05)。联合组CTGF和Ⅰ型胶原mRNA的表达与模型组比较有明显降低(P<0.05)；与低分子肝素组和依那普利组比较，联合组CTGF和Ⅰ型胶原mRNA的表达有明显降低(P<0.05)；低分子肝素组和依那普利单独治疗组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2

表2 各组大鼠肾组织CTGF和Ⅰ型胶原 mRNA的表达±s，n=8)

2.4Western印迹法结果 与假手术组大鼠相比,模型组UUO术后14 d CTGF蛋白表达增加,低分子肝素和依那普利组后,肾组织CTGF蛋白的表达均较模型组减少(P<0.05)；联合组CTGF的表达与模型组比较有明显降低(P<0.05)；与低分子肝素组和依那普利组比较，联合组CTGF的表达有明显降低(P<0.05)；低分子肝素组和依那普利单独治疗组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

1假手术组;2模型组;3低分子肝素组；4依那普利组；5联合组

3 讨 论

CFGF是新近发现的一种细胞因子，广泛存在于人类多种组织器官中，尤以肾脏中含量最高。CTGF因种类不同，表现不同的生物学效应，在肾脏中，CTGF对肾脏多种固有细胞，包括成纤维细胞、系膜细胞和肾小管上皮细胞有促增殖和促ECM合成的作用〔7〕。CTGF作为TGF-β的下游介质，在TGF-β的诱导下，由成纤维细胞分泌，介导TGF-β发挥促有丝分裂、细胞趋化、诱导黏附、细胞增殖和ECM合成等作用，而对TGF-β的抗炎、抗细胞分化作用无影响〔8〕。低分子肝素有抗凝、抗血栓和改善微循环的作用，并能减轻蛋白尿和延缓肾小球硬化〔9，10〕。

本研究前期试验发现依那普利对肾间质纤维化有防治作用,依那普利的抗纤维化作用在UUO术后14 d内效果好,这一作用机制与依那普利拮抗UUO早期血流动力学改变和肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活有关,进而抑制TGF-β1 / Smad通路的活化及肾小管上皮细胞的转分化有关。

本实验发现，LMWH和依那普利联合应用能明显减轻肾间质胶原沉积程度，减少损伤肾组织GTGF和Ⅰ型胶原mRNA的表达，联合用药的治疗作用优于低分子肝素和依那普利的单独应用，抗纤维化作用可能与抑制肾间质GTGF的表达，从而抑制胶原成分的合成有关。低分子肝素和依那普利组间比较结果显示，依那普利抗纤维化作用稍优于低分子肝素，这一作用可能与依那普利作为RAAS系统阻断剂的降压作用相关。本试验仅观察至UUO术后14 d，随着纤维化进程的延长，RAAS系统激活在肾间质纤维化的致病过程中所起的作用逐渐退居其次，依那普利抗纤维化作用不再突出。低分子肝素和依那普利的联合用药能通过多个靶点起到抗纤维化作用，随着纤维化进程的延长，抗纤维化作用可能逐渐显著。抗纤维化研究的观察时间点及低分子肝素安全的剂量范围有待于进一步的研究证实。

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