蛇床子素骨靶向药物对体外培养大鼠成骨细胞护骨素、核因子-κB受体活化因子配基表达的影响

马 勇 郭 杨 袁 涛 鲁俊山 刘尚仑 黄国淳

(南京中医药大学骨伤研究所，江苏 南京 210023)

蛇床子素是中药蛇床子的主要成分，具有刺激成骨细胞增殖，增强骨代谢活动,促进骨修复和骨重建以及抗骨质疏松等作用〔1，2〕。近年研究〔3，4〕发现成骨细胞分泌的RANKL能与破骨细胞及其前体上的核因子-κB受体活化因子配基(RANK)结合，促进成熟的破骨细胞形成。成骨细胞分泌的护骨素(OPG)可以与RANKL结合，竞争抑制RANKL与RANK之间的结合，有效抑制骨转换和破骨过程的活跃〔5〕。本文研究不同浓度的蛇床子素骨靶向药物(NSC-OST)对体外培养的成骨细胞OPG、RANKL表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 新生24 h内SD大鼠10只，性别、体重不限，由南京医科大学动物实验中心提供，合格证号：SCXK(苏)2008-0004。

1.2主要仪器与试剂 低糖DMEM培养基、胎牛血清(Hyclone 公司)；NSC-OST(中国药科大学新药研究中心提供)；胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、双抗(Gibco公司)；大鼠OPG酶联免疫试剂盒、大鼠RANKL酶联免疫试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司)；超净工作台(苏州华宇净化设备有限公司)；酶标仪(BioTeK 美国)；倒置式系统相差显微镜(Olympus 日本)。

1.3成骨细胞的分离、培养及纯化 新生24 h的SD乳大鼠双蒸水冲洗数次后夹颈处死，75%酒精中浸泡15 min；迅速取出头盖骨，并快速剔除附着的结缔组织及骨膜，无血清培养液冲洗3次至头盖骨呈白色，用眼科剪将其剪成约1 mm×1 mm大小的骨片；将碎骨片放入预先置有5 ml 0.25%胰蛋白酶的培养皿内，37℃条件下恒温消化20 min，弃去消化液，以清除纤维组织；然后将碎骨片加入预先置有5 ml 0.1%Ⅱ型胶原酶的培养皿内，37℃振荡器振荡，50次/min,60 min，消化2次，将2次收集的上清以1 000 r/min离心10 min，去上清；加入含15% FBS的低糖DMEM培养基制成单细胞悬液，调节细胞密度至106/ml，将细胞悬液接种于25 cm2培养瓶中培养。置于5% CO2、37℃培养箱中培养2 h后，吸出培养瓶内培养液移至第二瓶培养瓶中，培养10 min后，再同样接种到第三瓶培养瓶中，以达到纯化OB的目的。24 h后换液，除去未贴壁的细胞，每3天更换培养液1次，第2代的细胞即可用于实验。

1.4药物分组 取生长状态良好的第2代成骨细胞制成细胞悬液，以终浓度为1×105/ml接种于24孔培养板，并随机分为五组，对照组为不含NSC-OST的正常培养基，实验组为含NSC-OST的终浓度依次为10-7、10-6、10-5、10-4mmol/L组。24 h后成骨细胞贴壁，更换无血清培养液，待细胞周期同步化后，各组分别加入不同浓度NSC-OST进行培养，每2天更换培养液1次。

1.5成骨细胞OPG、RANKL表达检测 生长状态良好的第2代成骨细胞按上述方法培养7 d，取细胞上清，根据大鼠OPG ELISA试剂盒和大鼠RANKL ELISA试剂盒说明书进行检测：每组依次加入100 μl相应的样本，再将100 μl检测抗体加到每个孔中，空白孔除外，酶标板上加上覆膜，在37℃下孵育4 h，弃孔内液体，每孔用300 μl冲洗液冲洗3次，最后一次冲洗后，倒置在吸水纸上拍干多余水分；加100 μl的酶结合物到每个孔中，并用塑料膜盖上，在37℃下孵育1 h，每孔冲洗5次并拍干，再在每孔中加入100 μl底物液，室温下避光孵育30 min；加50 μl终止液到每个孔中，轻轻摇匀；在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，用酶标仪在450 nm波长测量每个孔的OD值。

2 结 果

2.1不同浓度NSC-OST对大鼠成骨细胞OPG、RANKL表达的影响 10-6、10-5mmol/L组对成骨细胞OPG的表达均有不同程度的促进作用，明显高于空白对照组(P<0.01)，且10-5mmol/L组促进OPG表达作用明显高于10-6mmol/L组(P<0.01)；10-7、10-6、10-5mmol/L组抑制成骨细胞分泌RANKL的作用高于空白对照组(P<0.05)，而10-6、10-5mmol/L两组间差异无统计学意义(P=0.35)。提示终浓度为10-6、10-5mmol/L组的NSC-OST具有促进成骨细胞OPG的表达和抑制其分泌RANKL的作用，且两组间抑制成骨细胞分泌RANKL的作用无明显差异，而10-5mmol/L组促进OPG表达的作用最为明显。见表1。

表1 不同浓度NSC-OST对大鼠成骨细胞OPG、RANKL表达的影响±s，n=8)

2.2不同浓度NSC-OST对大鼠成骨细胞OPG/RANKL比值的影响 10-6mmol/L、10-5mmol/L组可上调成骨细胞OPG/RANKL比值(2.04±0.13，2.35±0.29)，且明显高于空白对照组(1.54±0.11，P<0.01)；10-5mmol/L组上调OPG/RANKL比值效果优于10-6mmol/L组(P=0.02)。10-4、10-7mmol/L组的NSC-OST上调成骨细胞OPG/RANKL比值不明显(1.42±0.22，1.68±0.14，P>0.05)。

3 讨 论

人体骨组织处于不断重建过程之中，正常成人体内的骨矿沉积与骨吸收处于平衡状态，在病理状态下，骨形成的周期较骨吸收的周期长，新骨的形成相对旧骨的吸收不足，从而导致骨丢失〔6〕，产生各种骨疾病，近年来从分子生物学角度研究发现，RANK/RANKL/OPG系统与骨性疾病密切相关，是所有骨性疾病最为相关的治疗靶点〔7〕。因此研究RANK/RANKL/OPG系统在骨重建中的作用已成为防治骨疾病的热点。

RANKL是一种跨膜蛋白，主要由成骨细胞和激活的T细胞表达，是目前发现的参与破骨细胞调控的最重要的因子之一。RANKL可通过与破骨细胞表面的受体RANK结合，诱导前体破骨细胞分化成熟、增强破骨细胞运动能力并抑制破骨细胞的凋亡而间接促进其骨吸收功能〔8〕。本研究提示终浓度为10-6、10-5mmol/L NSC-OST可以抑制成骨细胞分泌RANKL。

OPG是由成骨细胞分泌的一种糖蛋白，可作为RANKL的天然阻滞受体，它通过与RANKL结合，竞争性地抑制RANKL与RANK的结合，而RANK是OC表面介导RANKL生物活性的唯一受体，所以可以特异性地抑制OC的增殖分化，降低其骨吸收功能，从而起到保护骨与关节的作用〔9〕。本实验说明10-6mmol/L和10-5mmol/L浓度的NSC-OST都能促进成骨细胞OPG的表达，且10-5mmol/L组效果最明显。

研究发现，RANK/RANKL/OPG系统是破骨细胞分化过程中的一个重要信号传导通路，是成骨细胞作用于破骨细胞的重要途径〔10〕，王艳等〔11〕研究发现蛇床子素可显著上调OPG mRNA表达水平，但对RANKL mRNA表达无影响，但最终可通过影响OPG/RANKL比值来抑制破骨细胞的骨吸收作用。可见，成骨细胞所表达的OPG和RANKL水平，尤其是OPG/RANKL比值，决定了其对分化破骨细胞的调控方向〔12〕。本研究显示，10-6、10-5mmol/L组的NSC-OST可上调成骨细胞OPG/RANKL比值，且10-5mmol/L组作用最为明显。

综上，蛇床子素骨靶向药物防治骨质疏松的机制可能是一方面直接抑制RANKL的分泌，降低破骨细胞的活性；另一方面促进成骨细胞分泌OPG，竞争性地阻断了一部分RANKL与RANK的结合，抑制了破骨细胞活化、成熟，达到抑制了骨吸收的目的。

4 参考文献

1明磊国,葛宝丰,陈克明,等.蛇床子素对体外培养成骨细胞增殖与分化成熟的影响〔J〕.中国骨伤,2010；23(9):688-91.

2明磊国,王鸣刚,陈克明,等.蛇床子素对体外培养成骨细胞成骨相关因子表达的影响〔J〕.中国药理与临床,2011；27(2):53-6.

3Boyce BF,Xing LP.Biology of RANK,RANKL,and osteoprotegerin〔J〕. Arthritis Res Thera,2007；9(Suppl 1):S1.

4Ann EK,Sundeep K,Paul K.RANKL and OPG regulation of bone remodeling in health and disease〔J〕.Endocr Rev,2008；29(2):155-92.

5Klejna K,Naumnik B,Gasowska K,etal.OPG/RANK/RANKL signaling system and its significance in nephrology〔J〕.Folia Histochem Cytobiol,2009；47(2):199-206.

6Deal C.Potential new drug targets for osteoporosis〔J〕.Nature Clin Pract Rheumatol,2009；5(3):20-7.

7Tanaka S.Signaling axis in osteoclast biology and therapeutic targeting in RANKL/RANK/OPG system〔J〕.Am J Nephrol，2007；27(5):466-78.

8Clohisy D.Cellular mechanisms of osteolysis〔J〕.Bone Joint Surg Am,2003；85(Suppl 1)：4-6.

9王振亮.石藤胶囊对类风湿性关节炎患者OPG和RANKL的影响〔J〕.辽宁中医杂志,2011；38(3):422-3.

10Silvestrini G,Ballanti P,Sebastiani M,etal.OPG and RANKL mRNA and protein expressions in the primary and secondary metaphyseal trabecular bone of PTH-treated rats are independent of that of SOST〔J〕.J Mol Hist,2008；39(2):237-42.

11王 艳,潘永梅.蛇床子素对新生大鼠颅骨成骨细胞中OPG、RANKL mRNA表达的影响〔J〕.山西中医学院学报,2008；9(3):12-4.

12张秀珍,杨黎娟.淫羊藿苷对成骨细胞中OPG RANKL mRNA表达的影响〔J〕.中华内分泌代谢杂志,2006；22(3):222-5.