联合检测粪便基因mRNA标志物的表达对结直肠癌的诊断

马 震 赵金伟 杨 震 曹春远

(吉林省人民医院，吉林 长春 130021)

通过对环氧合酶(COX-2)、细胞酶蛋白(CK-20)、黏附分子(CD44v6)mRNA在结直肠癌原发灶及病人粪便中的表达，证实粪便中COX-2、CK-20、CD44v6 mRNA表达来源于原发灶肿瘤细胞的脱落所致，粪便标本中COX-2、CK-20、CD44v6 mRNA的表达可以替代结直肠癌原发灶中标志物的表达，作为结直肠癌诊断检测指标〔1〕。

1 材料与方法

1.1临床资料 收集吉林省人民医院及吉林省肿瘤医院2008年1月至2010年2月行结直肠癌根治术的结直肠癌原发灶38例，均未行抗肿瘤治疗，其中男20例，女18例，年龄42～81〔平均(62±18.2)岁〕，Duke's A、B期13例，Duke's C、D期25例。分化程度：高中分化15例，未、低分化23例。患者术前2～3 d在医生指导下用带盖粪便标本盒收集粪便，在2 h内送于实验室，分装后-80℃保存，对术中切除的病变标本切取一部分置于标本盒内，置于-80℃冰箱中保存备用。粪便标本均为服药前或灌肠前留取标本。

1.2粪便标本的预处理 粪便标本解冻后，取成形粪便标本3～5 g或水样便100 ml加入100 ml液基细胞保存液100 ml搅拌均匀后，依次经过100目筛网，200目筛网，1 200 r/min离心10 min后弃去上清液，加提取液重悬沉淀至50 ml，过300目筛网，1 200 r/min离心10 min后弃去上清液，取沉淀加入液基细胞保存液1.5 ml置于1.5 ml Eppendorf管中，上述标本处理1 h完成，并置于-80℃冰箱中保存。

1.3PT-PCR法检测结直肠癌原发灶及粪便标本中基因mRNA表达

1.3.1总RNA的提取 用焦碳酸二乙酯(DEPC)严格处理实验器材以防止RNA酶污染。 解冻组织标本或粪便预处理后的标本，研磨后加入磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，1 000 r/min，5 min，弃上清，加1 ml Trizol，室温放置5 min，转到EP管加0.2 ml氯仿重悬沉淀，剧烈振摇，室温静置5 min，4℃12 000 r/min，离心15 min，上层水相移至另一EP管(宁少勿多)，加入0.5 ml冰异丙醇，充分混匀，室温放置10 min,4℃12 000 r/min，离心15 min，去上清，加入75%冰乙醇(DEPC)1 ml，振摇洗涤沉淀，4℃12 000 r/min，离心10 min，弃上清，去乙醇，空气中干燥RNA，加DEPC水(10～50 μl)，溶解RNA，所得的总RNA置于-80℃冰箱保存。

1.3.2RNA纯度及完整性检测 取RNA样品用紫外-可见光分光光度计于260 nm、280 nm处测定A值，计算RNA浓度和RNA定量。取RNA样品进行甲醛变性，1%琼脂糖凝胶电泳、拍照，用光密度扫描仪扫描28 s和18 s条带，计算密度比值。

1.3.3引物设计〔2〕实验所需引物及内参照β-actin引物均系上海生工生物工程公司合成，经GenBank检索为特异性引物。DNA Marker采用宝生物工程有限公司DL2000 Marker。

1.3.4RT-PCR技术检测COX-2，CK-20，CD44v6 mRNA表达 逆转录RNA 4 μl+Oligo dT 2 μl+DEPC 10 μl 72℃,5 min，变性模板RNA-迅速放置冰上，复性模板RNA-5×buffer 5 μl+10 mmol/L dNTP 2 μl+25 U/μl Rnasin 1 μl+200 U/μL mmlV 1 μl 42℃,1 h 94℃,5 min冰上，5 min,置-80℃储存。聚合酶链式反应：反应体系：灭菌去离子水32 μl，10倍PCR缓冲液5 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，10 pmol上游引物1 μl，10 pmol下游引物1 μl，cDNA(0.1μg/μl)1 μl，Taq DNA聚合酶(2 U/μl)0.2 μl。扩增条件β-actin：取cDNA 2 μl，加入10倍缓冲液2 μl，25 mmol/L氯化镁溶液1.2 μl，Taq酶1 U，22.5 mmol/L dNTPs 0.16 μl，β-actin引物0.1 μg，加去离子水至20 μl进行PCP扩增。每次设一管不加样品cDNA为阴性对照。反应条件为94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环，72℃延长7 min。基因扩增产物经2%琼脂糖凝胶(含0.1%溴化乙啶)电泳，拍照。目的基因: 逆转录产物2 μl，加入10倍PCR缓冲液3 μl，目的基因引物20 pmol，上下游引物4 pmol，Taq DNA酶1 U， DEPC处理水至30 μl。反应条件为95℃预变性2 min，95℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共45个循环。基因扩增产物经2%琼脂糖凝胶(含0.1%溴化乙啶)电泳、拍照。

1.3.5结果判定 图片中出现305 bp、370 bp、125 bp的条带分别为COX-2、CK-20及CD44v6 mRNA表达阳性。

1.4统计学处理 采用χ2检验，应用SPSS10.0软件。

2 结 果

2.1粪便标本COX-2 mRNA表达与大肠癌的相关性 在38例结直肠癌粪便标本中，18例(47.4%)COX-2 mRNA表达阳性，在22例健康对照组中，3例(13.6%)表达阳性，二者相比差异显著(P=0.0083)。

2.2粪便标本CK-20 mRNA表达与大肠癌的相关性 结直肠组癌粪便标本中， 21例(55.3%)CK-20 mRNA表达阳性，健康对照组4例(18.2%)表达阳性，差异显著(P=0.005)。

2.3粪便标本CD44v6 mRNA表达与大肠癌的相关性 结直肠组粪便标本中，19例(50.0%)CD44v6 mRNA表达阳性，健康对照组2例(9.0%)表达阳性，二者相比差异显著(P=0.001 4)。

2.4联合检测粪便基因mRNA表达对大肠癌的诊断分析 在38例结直肠癌粪便标本中，COX-2 mRNA、CK-20 mRNA、CD44v6 mRNA联合检测的阳性率为86.8(33/38),与单一指标相比差异显著(P<0.05)。联合检测对大肠癌诊断的敏感性(Se)、特异性(Sp)、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)及准确性(Ac)，见表1。

表1 联合检测粪便基因mRNA表达对结直肠癌的诊断分析

3 讨 论

对于结直肠癌病人的筛查，未来的热点是在非肠道准备下易被患者接受的检查〔3〕。粪便基因检测法是检测患者粪便基因的改变，无侵袭性、无须特殊准备，且可检查整个大肠病变，是目前无创性筛查大肠肿瘤病变的研究热点。

目前，粪便基因mRNA标志物的研究刚刚起步，日本学者分析发现，COX-2 mRNA 表达对结肠癌诊断的敏感性和特异性分别为90%，100%。但Leung等〔4〕研究显示，COX-2 mRNA表达在结直肠癌中的阳性率仅为50%，腺瘤仅为4%，因此，粪便基因mRNA表达大肠癌诊断有待于进一步研究，联合检测粪便多个基因mRNA表达是否能用于大肠癌的筛查也有待于进一步研究。

本研究结果发现，CD44、COX-2、CK-20 mRNA在结直肠癌病人原发灶及粪便中表达具有较高的同源性，通过检测粪便标本中CD44、COX-2、CK-20 mRNA表达替代检测原发灶中CD44、COX-2、CK-20 mRNA表达用于肿瘤的诊断、预后等。本实验结果表明，粪便标本CK-20、CD44v6及COX-2 mRNA可作为大肠癌的无创性诊断指标，但因单一检测的阳性率较低，本实验结果表明联合检测更具有临床应用价值。Ahlqiust〔5〕在2000年首次报道了粪便多基因联合检测用于结直肠癌的研究结果，联合检APC、K-ras、BAT26、P53和L-DNA,结肠敏感性为91%，去除K-ras后的敏感性保持为91%，特异性增加为100%。Akkiprik等〔6〕的研究表明，DCC，P53，K-ras三种基因中，最常联合应用的是DCC和P53(7%)，K-ras和P53联合的只有2.3%。对比粪便基因DNA标志物的联合检测，本实验采用三种标志物联合检测有较高的敏感性及特异性，这也是检测粪mRNA 的优势所在。

4 参考文献

1大肠癌原发灶及粪便标本中基因mRNA表达及其临床意义〔J〕.中国实验诊断学,2012;16(8):1391-4.

2Winawer S,Fletcher R,Rex D,etal.Colorectal cancer screening and surveillance〔J〕.Gastroenterology,2003;124():544-60.

3Pickhardt PJ,Choi JR,Hwang I,etal.Computed tomographic virtual colonoscopy to screen for colorectal neoplasia in asymptomatic adults〔J〕.N Engl J Med,2003;349:2191-200.

4Leung WK,To KE,Man EP,etal.Detection of hypermethylated DNA or cyclooxygenase-2 messenger RNA in fecal samples of patients with colorectal cancer or polyps〔J〕.Am J Gastroenteral,2007;102(5):1070-6.

5Ahlquist DA.Stool-based DNA tests for colorectal cancer:clinical potential and early results〔J〕.Per Gastroenterol Disord,2002;2(1): s20-6.

6Akkiprik M,Ataizi-Celikel C,Dusunceli F,etal.Clinical significance of p53,k-ras and DCC gene alternations in the stage Ⅰ-Ⅱ colorectal cancers〔J〕.J Gastrointest Liver Dis,2007;16(1): 11-7.