琐琐葡萄齐墩果酸对Aβ25～35诱导PC12细胞损伤的保护作用

袁 芳 刘 涛 马 龙

(新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011)

中药及保健功能性食物预防和治疗阿尔茨海默病(AD)的作用日益受到重视〔1〕。国内外研究显示，葡萄提取物能预防AD，对原花青素、白藜芦醇等葡萄提取物的抗痴呆作用报道较多，但未见对葡萄提取的三萜类物质研究〔2～4〕。琐琐葡萄为葡萄科葡萄属植物山葡萄，我国主产于新疆吐鲁番、和田、鄯善等地，是医药文献如《神农本草经》、《维吾尔药志》等所记载的药用葡萄品种之一。齐墩果酸(OA)是一种五环三萜类化合物，在琐琐葡萄提取的总三萜中的平均含量为65.52%。本研究通过建立AD大鼠模型，发现琐琐葡萄提取的总三萜具有抗AD作用〔5〕。本研究利用Aβ25～35诱导PC12细胞，制备具有拟AD样病理变化的体外细胞模型，研究OA对神经细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1药品试剂与仪器 琐琐葡萄购自新疆维吾尔自治区吐鲁番维药市场，新疆药物研究所鉴定。课题组提取OA，二甲亚砜(DMSO)溶解，0.22 μm尼龙滤膜过滤除菌，-20℃避光保存，临用时用完全培养基稀释，DMSO浓度低于1‰。DMEM培养液(美国Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；Aβ25～35(Sigma公司)；CCK-8检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物研究所)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(BioVision)；Trizol(Invitrogen)；逆转录试剂盒(TaKaRa)，荧光定量(Invitrogen)。垂直流超净化台(美国Thermo公司)，二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)，全自动酶标仪(美国Bio-Rad公司)，流式细胞仪(BD LSRⅡ)，倒置荧光显微镜(LEICA DFC490，德国)，实时PCR仪(7700型，美国ABI公司)。

1.2Aβ25～35诱导 PC12 细胞损伤模型的建立 PC12细胞(高分化)购自中国科学院上海细胞生物学研究所。细胞常规培养，DMEM高糖培养基含10%灭活胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，置37℃、5% CO2饱和湿度的恒温培养箱，隔天换液，3～4 d传代。取对数生长期的PC12细胞，计数后5×104/ml接种于96孔板，每孔100 μl，培养至贴壁后，分别加入0、10、20、30、40 μmol/L的Aβ25～35(1 mmol/L的Aβ25～35置于37℃老化7 d，临用前稀释)，在孵箱中继续培养24 h后检测细胞的存活率。

1.3CCK-8试剂盒测定细胞存活率 对数生长期的PC12细胞5×104/ml接种于96孔板，保护组加入OA，终浓度为20、40、80 μg/ml，预处理4 h后，除对照组外加入Aβ25～35，使之终浓度为20 μmol/L，继续培养24 h，每孔加入CCK-8 10 μl，继续培养1 h，酶标仪450 nm测定吸光度，计算PC12细胞存活率。

1.4LDH检测 Aβ25～35诱导24 h后，分别收集各组细胞上清液，按试剂盒说明书操作，计算各组细胞上清液LDH活性。

1.5SOD、MDA检测 按上述方法收集各组细胞上清液，按试剂盒说明书操作，分光光度计测定吸光度，每组设5个复孔，实验重复3次。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡 细胞接种于6孔板，按上述方法分组并培养细胞，将各组的细胞消化后收集，1 000 r/min离心5 min，用冷DMEM洗涤2次，结合缓冲液中重悬成单细胞悬液，密度为1×106/ml，室温下加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染料，轻轻振荡、混匀，室温下避光孵育15 min，流式细胞仪测定细胞凋亡率。

1.7实时荧光定量PCR检测NF-κB p65基因表达 细胞接种6孔板，按上述方法分组培养细胞，Trizol法提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计分析RNA浓度和纯度。逆转录合成cDNA。cDNA 加入荧光定量PCR反应体系。根据GenBank序列，引物和探针设计软件Primer 5.0设计引物序列。所用的引物及内参β-actin引物由鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。数据采用双标准曲线法处理，样本的相对定量=目的基因含量/内参基因含量，计算待测组目的基因相对于对照组的表达差异倍数。引物序列见表1。

表1 引物序列

2 结 果

2.1Aβ25～35对PC12细胞活性的影响 终浓度分别为10、20、30、40 μmol/L的Aβ25～35与PC12细胞作用24 h后，与对照组(100%)细胞比较，细胞存活率逐渐降低，其IC50约为20 μmol/L。本课题后续实验采用20 μmol/L的Aβ25～35作用PC12细胞24 h制备AD细胞模型。

2.2OA对PC12细胞存活率的影响 与对照组比较，模型组细胞生长受到抑制，细胞存活率下降为68.03%(P<0.01)；与模型组相比，OA保护组细胞存活率有明显增加(P<0.05)。见表1。

2.3OA对Aβ25～35诱导的PC12细胞LDH、SOD、MDA的影响 与对照组比较，模型组细胞的LDH活性明显增加、SOD活性明显下降、MDA含量增高(P<0.01)；与模型组相比，OA组细胞LDH活性明显降低、SOD活性增加、MDA含量降低(P<0.01)。见表2。

2.4OA对PC12细胞凋亡率的影响 对照组细胞凋亡率(4.58%)明显低于模型组凋亡率(35.18%)(P<0.01)；与模型组相比，80、40、20 μg/ml OA组凋亡率(8.88%、12.94%和15.15%)均明显下降(P<0.05)。

2.5NF-κB p65 mRNA表达 与对照组相比，模型组NF-κB p65表达上调(3.53±0.51 vs 1.00±0.00，P<0.01)；与模型组相比，80、40、20 μg/ml OA保护组NF-κB p65表达降低(0.99±0.07、1.73±0.02、0.60±0.19，P<0.01)。

表1 OA对Aβ25～35诱导的PC12损伤的影响±s,n=4)

表2 OA对Aβ25～35诱导的PC12细胞SOD、MDA活性的影响±s,n=5)

3 讨 论

Aβ分子中决定其毒性的主要片段在25～35，常用于诱导AD的体外细胞模型〔6，7〕。PC12细胞为大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤克隆化的细胞株，1976年由Greene等建立，具有较典型的神经内分泌细胞特性，已广泛用作神经细胞体外模型〔8，9〕。本研究采用20 μmol/L Aβ25～35作用于PC12细胞24 h，结果显示模型组细胞存活率下降至58%，细胞凋亡率显著增加，表明此模型可以作为评价OA神经保护效果的神经损伤体外模型。

CCK-8试剂盒是检测细胞增殖、细胞毒性的试剂盒，为MTT法的替代方法，具有灵敏度高、数据可靠、重现性好的优点。LDH是细胞内标志酶，当细胞膜的完整性遭到破坏，胞质中LDH大量释放到细胞外，其漏出量与细胞受损程度相平行。因此，它们是检测细胞功能状态、受损程度和存活数量的重要指标。本实验结果表明OA对神经细胞的损伤具有保护作用。

在正常情况下，机体内自由基的产生和清除系统处于动态平衡状态，Aβ可通过诱导产生氧自由基使脑细胞膜系统的脂质和蛋白被氧化修饰，使活性氧增加，促进氧化反应和过氧化物形成，诱导氧化应激损伤，降低抗氧化作用，自由基损伤是Aβ发挥细胞毒性的方式之一。氧自由基也可促进生成Aβ，二者具有相互促进效应。神经细胞丢失是AD的一个重要特征，细胞凋亡是丢失的重要前提，Aβ能引起神经细胞的凋亡。SOD和MDA是反映自由基损伤最具有代表性指标。本实验结果提示细胞损伤与脂质过氧化有关，OA可能通过抗氧化、抗凋亡起到对神经细胞损伤的保护作用。

核因子-κB(NF-κB)是具有多向转录调节作用的蛋白质，NF-κB/IκB信号转导途径被认为是炎症及凋亡信号转导的关键。Aβ可以直接或间接产生氧自由基(ROS)，ROS可激活神经元内的 NF-κB，进而通过炎症反应、氧化应激和细胞的凋亡等多途径参与 AD 的发病过程〔10〕。本研究提示Aβ25～35通过激活NF-κB信号通路，诱导NF-κBp65 mRNA过度表达，引起细胞凋亡；OA可降低Aβ诱导的NF-κB表达，抑制细胞凋亡，保护神经细胞。

本研究表明OA对AD细胞模型具有保护作用，通过其抗氧化活性增强清除氧自由基能力，减少脂质过氧化反应，调节NF-κBp65 mRNA的表达抑制神经细胞凋亡。OA作为一种天然化合物，不仅毒副作用低，而且可通过抗氧化、抑制细胞凋亡多方面保护神经细胞损伤，具有开发为抗痴呆、抗衰老药物前景，本实验为维药琐琐葡萄防治AD等神经系统疾病提供科学依据，为促进维药的理论发展，同时也为充分利用新疆丰富的葡萄资源，研发安全、有效、价廉AD民族新药提供新思路。

4 参考文献

1马 涛，张文生，王永彦.天然药物治疗阿尔茨海默病的研究进展〔J〕.北京中医药大学学报，2009；32(9)：641-5.

2Wang J，Ho L，Zhao W，etal.Grape-derived polyphenolics prevent Aβ oligomerization and attenuate cognitive deterioration in a mouse model of Alzheimer′s disease〔J〕. J Neurosci，2008；28(25):6388-92.

3Ono K，Condron MM，Ho L，etal.Effects of grape seed-derived polyphenols on amyloid-protein self-assembly and cytotoxicity〔J〕. J Biol Chem，2008；283(47)：32176-87.

4曹霞飞，郑 翔，吴 俊，等.白藜芦醇对甲醛诱导PC12细胞氧化损伤的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(8)：3062-5.

5洪 玉，马 龙，周晓辉，等.葡萄皮提取物对拟痴呆模型大鼠干预作用的研究〔J〕.中国老年学杂志，2005；25(2)：195-7.

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9Silva JP，Gomes AC，Coutinho OP.Oxidative DNA damage protection and repair by polyphenolic compounds in PC12 cells 〔J〕.Eur J Pharmacol，2008；601(1)：50-60.

10Lee SY，Lee JW，Lee H，etal.Inhibitory effect of green tea extract on beta-amyloid-induced PC12 cell death by inhibition of the activation of NF-kappaB and ERK/p38 MAP kinase pathway through antioxidant mechanisms〔J〕.Brain Res Mol Brain Res，2005;140(1/2)：45-54.