三维钛网支架材料对犬牙周膜成纤维细胞生物学行为的影响

张圣福 黄元丁 王 涛

(重庆市口腔疾病与生物医学研究中心 重庆医科大学附属口腔医院，重庆 401147)

牙周膜成纤维细胞(PDLFs)经证实具有异质性，除了具有成纤维性能，而且可以向成牙骨质和成骨方向分化，已经成为牙周组织工程首选的种子细胞〔1〕。三维钛网支架(TW)是由直径50 μm钛丝编织而成的圆盘状支架，高度2～10 mm，平均孔径200 μm，孔隙率87%，Dong等学者证实此支架具有良好的生物相容性和生物安全性，较传统的二维培养环境能有效促进细胞和组织的附着，增殖，能促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化〔2〕。TW在骨组织工程和牙周组织再生工程中具有良好的应用前景〔3〕，本实验通过体外培养PDLFs，通过与TW支架材料三维培养，检测TW对其附着、增殖及分化的影响，为牙周组织工程种子细胞及支架材料提供实验基础。

1 材料与方法

1.1实验动物 1周岁beagle犬，由重庆医科大学实验动物中心提供〔动物质量合格证号：SCXK(渝)2007-0001〕。

1.2主要试剂和仪器 胎牛血清(Gbico)，DMEM：F12培养基(HyClone)，胰蛋白酶、I型胶原酶(Sigma)，青霉素、链霉素(HyClone)，地塞米松、维生素C、β-磷酸甘油钠(Sigma)，抗波形蛋白抗体(Abcam)，抗角蛋白抗体(LSBio)，噻唑蓝(MTT)试剂盒(碧云天)，AKP检测试剂盒(南京建成)，CO2恒温培养箱(Thermo)、超净工作台(苏州医疗设备厂)、光学显微镜(Olympus)、倒置相差显微镜(Nikon)，透射电镜、扫描电镜(Hitachi)。

1.3方法 酶消化组织块法体外原代培养犬PDLFs〔4〕，3%戊巴比妥钠按腹腔注射麻醉1周岁年龄beagle犬(1 ml/kg)，2%利多卡因局部浸润麻醉拔除上下前牙约10颗，冠向下，根朝上，用预冷无菌磷酸盐缓冲液(PBS，含200 U/ml青霉素、200 U/ml链霉素)反复冲洗血污3次以上，转入生物安全柜内，用含有双抗的无菌PBS再次反复冲洗离体牙，用刀片刮取牙根中1/3的牙周膜组织，勿用眼科剪分，避免再次损失组织块。将组织块移入5 ml离心管中，加入0.1%胶原酶和0.25%胰蛋白酶各0.5 ml，37℃消化30 min，每5 min振荡1次，当肉眼观察到培养液略混浊，显微镜下见组织块松散时，离心(800～1 000 r/min，5 min)，弃上清液，用含20%胎牛血清及双抗(100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素)的DEME和F12(1∶1)培养基漂洗1次后弃上清液，收集组织块，将组织块平铺于50 ml塑料培养瓶底，翻转培养瓶，底部朝上，向内加入上述完全培养基1 ml，置5%CO2、37 ℃培养箱孵育4 h，使组织块贴壁，再复原培养瓶培养，3 d后更换培养基，操作时动作轻柔，避免组织块脱离瓶底。取第3代细胞用于实验。

1.4透射电镜观察超微结构 取第3代细胞，PBS漂洗，细胞刮刮取细胞，离心，稀释制成107/ml高浓度细胞悬液，将细胞悬液加入做好的琼脂管中(eppendorf管中加入2%的琼脂，中间用牙签弄个小洞)，离心后，切开eppendorf管，切去多余的琼脂，留下包埋细胞的琼脂块，用2.5%的戊二醛、1%的锇酸双固定，梯度酒精脱水、渗透、包埋、聚合、超薄切片，染色，观察。

1.5细胞组织来源鉴定 取第3代细胞，0.25%胰酶消化，离心，制作单层细胞爬片，用酶联免疫(SP)法，二氨基联苯胺(DAB)显色进行波形蛋白和角蛋白抗体免疫细胞化学染色，设置空白、阴性对照。

1.6矿化结节实验鉴定 取第3代细胞消化后接种六孔板，待细胞贴壁后，加入含10 mmol/L β-甘油磷酸钠、100 μg/ml维生素C、10 nmol/L地塞米松的完全培养基，约3 w出现白色的矿化结节，PBS漂洗，95%乙醇固定10 min，蒸馏水冲洗数次，0.1%茜素红(Tris-HCl pH8.3)染色30 min，PBS冲洗数次，自然干燥，照相。

1.7TW对犬PDLFs的生物学行为的影响 取6只TW放在10 ml离心管底部，用常用细胞培养培养液4 ml，反复吹打，静置2 h，取出预湿过的钛网放入96孔板，取第3代细胞消化离心稀释制成浓度104/ml细胞悬液，慢慢滴入TW内部，24 h后取出TW放入新96孔板，常规培养。取培养1 w后TW行戊二醛固定、脱水、置换、临界点干燥、喷金、扫描电镜观察细胞附着增殖。取12只预湿过的TW放入96孔板为实验组，取另12孔位对照组，再取12孔为空白组(只加入培养液)，取第3代细胞制104/ml成细胞悬液，实验组、对照组每孔反复滴入TW 200 μl，分别培养2、4、6、8 d后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，继续培养4 h后，小心吸去孔内培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，取出钛网，在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光度值，根据各时间点，各组数据均值绘制柱状图。实验组取12只预湿过的TW放入24孔板的，取第3代细胞制成细胞悬液反复滴入TW各1 ml，常规复合培养基培养，对照组取第3代细胞制成细胞悬液滴入12孔，各1 ml，采用含矿化诱导液的复合培养基培养，两组细胞经培养24、48、72 h后消化，离心，细胞裂解液裂解，离心取上清液，用碱性磷酸酶(AKP)试剂盒检测AKP含量。

1.8统计学方法 应用SPSS13.0软件进行分析，实验组和对照组在各个时间点采用方差分析，t检验。

2 结 果

2.1细胞原代培养及鉴定 组织块经酶消化接种5～7 d，在倒置显微镜下可见梭形细胞从组织块边缘呈发射状游出，约2 w可将原代细胞消化传代(图1A)。经传代的细胞以长梭形和星形为主，也有多角形，胞体丰满，有2～4个梭形细胞突起，胞质均匀，核圆形或卵圆形，核仁清晰，呈较典型的成纤维细胞样形态；细胞铺满培养瓶时呈放射状、漩涡状排列(图1B)。透射电镜下PDLFs有丰富的粗面内质网、高尔基复合体、核糖体；显示细胞为处于生长旺盛的PDLFs(图1C)。光镜下观察免疫细胞化学染色波形丝蛋白抗体呈阳性(图1D)，角蛋白阴性(图1E)，证明细胞来源于中胚层，无上皮细胞来源混杂。细胞经矿化诱导培养3 w后出现矿化结节，茜素红染色阳性，证明经培养的PDLFs具有向硬组织分化的能力(图1F)。PDLFs在材料表面附着伸展良好，主要呈长梭形，细胞生长密集处伸出突起相互连接。

A

B

C

D

E

F

2.2PDLFs增殖比较 牙周膜成纤维附着TW后细胞增殖的幅度较单独二维培养有所增加。见图2。

图2 MTT实验检测两组细胞培养2、4、6、8 d后的增殖水平

2.3PDLFs上清液AKP水平比较 在24 h，两组细胞上清液AKP分泌水平差异无统计学差异(P>0.05)，而在48、72 h，TW组分泌量显著多于矿化诱导组(P<0.05)。见表1。

表1 上清液AKP含量(金氏单位/100 ml)比较±s)

3 讨 论

PDLFs是牙周组织再生的前体细胞，是PDL 的主要细胞成分，也是PDL 的主要功能细胞，PDLFs具有成纤维表型和成骨表型，其中，成骨表型包括成牙骨质细胞表型和成骨细胞表型〔5〕，能分化为成骨细胞、成牙骨质细胞、成纤维细胞，具有形成牙骨质、牙槽骨及牙周膜的能力〔6〕。Hasegawa等〔7〕将PDLFs制成细胞皮片，再复合细胞外基质植入免疫缺陷小鼠皮下，发现有非细胞性牙骨质形成，且有大量的密集排列的胶原纤维插入其中。此外，有学者利用具有多向分化能力的PDLFs均取得了向类牙骨质和牙周膜纤维方向诱导分化的成功，使其成为牙周组织工程最重要的种子细胞〔8〕。

目前牙周膜细胞原代培养的方法主要有酶消化法和组织块法，酶消化法操作方法复杂，获得的细胞不纯，组织块法有细胞游出比较缓慢且数量少的缺点〔9〕。本实验通过电子显微镜观察到细胞形态均为长梭形星形或多角形细胞未发现上皮样细胞，免疫细胞化学染色波形蛋白呈阳性反应，说明细胞来源于中胚层，角蛋白阴性排除上皮性来源细胞混杂，细胞来源可靠，透射电镜观察细胞超微结构，含有丰富的高尔基体和粗面内质网，说明所培养的细胞合成蛋白质功能活跃，矿化结节实验证明其有向硬组织分化的能力。

因为钛材料具有杰出的生物相容性和生物安全性、优良的耐腐蚀性、适宜的力学性能和良好的加工性，广泛应用于口腔各种修复体的制作，尤其是骨结合理论的创立和发展，钛种植体已经成为牙种植体最重要、最广泛的一种。众多学者将钛材料和PDLFs等种子细胞用于牙周组织工程研究。如Choi将狗PDLFs分离培养后附着到钛种植体表面，再植入同源性狗的下颌骨内，3个月后组织切片发现种植体表面有类牙骨质形成，并有胶原纤维垂直插入其中〔10〕。

目前，临床上大部分种植体通过酸蚀、喷砂等手段改变种植体表面形态，但仍然属于二维结构。TW材料可通过高温真空焊接到钛柱表面，形成三维结构的种植体。将高密度细胞接种在具有一定空间结构，有一定孔隙率，孔径大小，孔间交通的支架材料上，细胞在模拟体内细胞的化学、物理和生物学条件下，在三维基质支架中进行培养称为三维培养〔11〕。通过将体外培养的PDLFs接种到TW上复合立体培养，使与牙周组织的主要功能细胞PDLCs直接接触，检测材料对细胞增殖分化的影响，为TW材料构建牙周组织工程支架的可能性提供初步的研究数据，本次实验验证钛网材料三维培养较二维培养具有明显的促增殖作用。

PDLFs成骨表型和成牙骨质表型都可以分泌AKP，而AKP的表达可作为牙骨质形成过程中成骨细胞或成牙骨质细胞分化早期的标志，矿化组织的形成则可作为其分化末期的指标〔12〕。本实验发现TW材料对于PDLFs早期促矿化的能力要优于传统矿化诱导培养液。

综上所述，TW材料能有效促进犬PDLFs附着增殖、分化，为后期牙周组织工程再生相关种子细胞的选择和支架材料的构建提供理论和基础，为口腔常见牙周病、牙列缺损缺失提供治疗思路〔13〕。

4 参考文献

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7Hasegawa M，Yamato M，Kikuchi A,etal.Human periodontal ligament cell sheets can regenerate periodontal ligament tissue in an athymic rat model〔J〕.Tissue Eng，2005；11(3-4)：469-78.

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9李 隽，胥 春，郝 轶，等.人牙周膜细胞原代培养及鉴定〔J〕.上海交通大学学报(医学版)，2008；28(11)：1373-6.

10Choi BH.Periodontal ligament formation around titanium implants using cultured periodontal ligament cells：a pilot study〔J〕.Int J Oral Maxillofac Implants，2000；15(2)：193.

11Cao Y，Li D，Shang C,etal.Three-dimensional culture of human mesenchymal stem cells in a polyethylene terephthalate matrix〔J〕.Biomed Mate，2010;5(6):065013.

12Lin NH，GronthosS，Bartold PM.Stem cells and periodontal regeneration〔J〕.Australian Dental Journal，2008;53(2)：108-121.

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