丹参酮ⅡA诱导PC-3细胞凋亡的细胞周期调控机制

康郑军 李 伟 王 坦 朱艳琴 沈晓君

(郑州大学第五附属医院，河南 郑州 450052)

前列腺癌严重威胁男性健康。内分泌治疗通过去除或阻止雄激素对前列腺癌细胞产生作用，暂时抑制前列腺癌细胞的生长，延缓疾病的恶化进展，但晚期特别是转变为雄激素非依赖性的前列腺癌，则成为临床治疗的难点。丹参酮ⅡA是从丹参中提取出来的脂溶性有效成分之一，本实验通过观察丹参酮ⅡA对PC-3人前列腺癌细胞周期及细胞周期调控相关蛋白CyclinD1和CDK4表达的影响，探讨其拮抗PC-3增殖的机制。

1 材料与方法

1.1细胞株 PC-3人前列腺癌细胞购自中国科学院细胞库。

1.2药品及试剂 丹参酮ⅡA对照品购自中国药品生物制品鉴定所,20 mg/瓶,批号：200619。鼠抗人CyclinD1单克隆抗体，兔抗人CDK4单克隆抗体，羊抗鼠FITC-IgG(1∶400)，羊抗兔FITC-IgG(1∶400)试剂均购自Santa cruz。胎牛血清购自杭州四季青公司；胰蛋白酶、DMEM为Gibco BRL产品。

1.3主要仪器 BD公司FACS Calibur流式细胞仪；苏净集团安泰公司209b型超净工作台；德国GMBH公司Hera CO2细胞培养箱；日本Olympsu Optical公司BH-NIC-B型倒置显微镜。

1.4细胞培养与实验分组 在37℃、5%CO2条件下，用加入终浓度为100 mg/L的链霉素与青霉素、含有10%小牛血清的PRMI-1640培养基培养PC-3细胞，含0.01%EDTA的0.25%胰酶进行消化传代，处于对数生长期的第3～5代细胞用于实验。按1×108/L密度稀释后接种于96孔培养板每组设6个复孔，培养24 h。将细胞分为对照组和丹参酮ⅡA处理组。丹参酮ⅡA处理组分别加入终浓度0.25、0.5、1 mg/L的丹参酮ⅡA，培养48 h后，终止培养。

1.5MTT法细胞增殖能力检测 收集细胞，各组加入 MTT(5 mg/ml)液20 μl/孔，继续培养4 h，去上清，加入150 μl/孔二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，上酶标仪490 nm处测吸光度值。

1.6细胞周期分析 取生长状态良好的细胞胰酶消化后制备细胞悬液，1 000 r/min，离心5 min，弃上清；PBS洗涤2次；离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃避光固定过夜。800 r/min离心10 min，去上清，PBS清洗两次；重悬细胞于500 μl含100 U/ml RNaseA 的PBS 缓冲液中，避光37℃，温浴30 min；加2 mg/ml 碘化丙啶(PI)至终浓度50 μg/ml，混匀，避光孵育30 min。以PI荧光读数为横坐标，细胞数为纵坐标，用流式细胞术(FCM)检测细胞周期中不同时相的细胞数。

1.7细胞周期调控相关蛋白CyclinD1、CDK4表达的检测 调整细胞浓度为1×106/ml个，将细胞悬液置于试管中，加入兔抗人CDK4单抗(1∶100)、鼠抗人CyclinD1(1∶100)100 μl，室温孵育30 min，PBS洗涤1次，300～500 r/min离心5 min，去上清，加入羊抗兔FITC-IgG 二抗(1∶400)、羊抗鼠FITC-IgG(1∶400)100 μl，避光室温孵育30 min，PBS洗涤1次，300～500 r/min离心5 min，弃上清，加入1 ml PBS液，500目铜网过滤后上机检测，同时设PBS代替一抗和二抗、仅加一抗、仅加二抗的阴性对照，每份标本测定5 000个细胞。

1.8统计学方法 采用SPSS10.0软件包进行单因素方差分析和LSD方法。

2 结 果

2.1丹参酮ⅡA对PC-3细胞增殖能力的影响 与对照组(0.98±0.02)比较。0.25、0.5、1 mg/L的丹参酮ⅡA组OD值(490 nm)分别为(0.79±0.03)、(0.77±0.02)、(0.75±0.03)，显著降低(P<0.05)。

2.2丹参酮ⅡA对PC-3细胞周期的影响 丹参酮ⅡA 3个药物剂量组S期细胞数均明显减少，G0/G1期细胞数均增多，与对照组比较差异显著(P<0.05，P<0.01)。见表1。

表1 丹参酮ⅡA对PC-3细胞增殖周期的影响±s,%，n=6)

2.3丹参酮ⅡA对PC-3细胞CyclinD1、CDK4表达的影响 丹参酮ⅡA处理组细胞CyclinD1、CDK4表达随丹参酮ⅡA剂量增加而明显减少，与对照组比较差异显著(P<0.05，P<0.01)，见表2。

表2 丹参酮ⅡA对PC-3细胞CyclinD1、CDK4表达的影响±s,n=6)

3 讨 论

细胞周期是一个按特点顺序发生的复杂过程，涉及大量调节蛋白，其核心是Cyclin和CDK，二者在细胞周期的各个阶段者细胞生命活动的过程。CDK通过与Cyclin结合，形成周期素依赖性激酶复合物而活化，活化的CDK可使其底物蛋白的丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化修饰，并进而引发与细胞周期进程相关的一系列变化〔1〕。Cyclin是通过活化CDK来调控细胞周期的蛋白家族，其本身没有酶活性。当细胞中含量低时，Cyclin与CDK解离，CDK的活性因而受到抑制。CDK4、CyclinD1均为重要的细胞周期蛋白调控基因，CDK4是CDK复合物中的催化亚基，CyclinD1/ CDK4在G1/S期过渡中发挥重要的调控作用，即CyclinD1和CDK4作为细胞分裂周期起始点G1/S期的正性调节因子，驱动细胞由G1期前行，使细胞分裂加速〔2〕。G1末期向S期是否顺利过渡意味着细胞是否由G1期进入S期，此时细胞内相关基因表达水平发生及时而有显著变化，为下阶段DNA复制做好准备，因此这一转变对于推进肿瘤细胞周期进程具有重要意义〔3〕。

丹参酮是丹参根乙醚提取物中的成分，为丹参主要有效作用部位，丹参酮ⅡA是其脂溶性成分的代表〔4〕。研究表明，丹参酮ⅡA除了传统的心血管药理作用外，还可以通过诱导凋亡、抑制侵袭和转移等多种机制发挥抗肿瘤作用,具有开发成低毒高效抗肿瘤药物的广阔前景。李健等〔5〕研究发现，丹参酮ⅡA可诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡，其机制与细胞周期阻滞、上调凋亡相关基因的表达有关。王江峰等〔6〕研究证实丹参酮ⅡA可通过干预细胞周期促进人耐药非小细胞肺癌细胞株凋亡。本研究结果证实丹参酮ⅡA可抑制PC-3细胞增殖，其主要机制与CyclinD1及CDK4的低表达所致的细胞周期抑制有关。但是，丹参酮ⅡA这种药理学作用途径有待研究。

4 参考文献

1Suryadinata R,Sadowski M,Sarcevic B.Control of cell cycle progression by phosphorylation of cyclin-dependent kinase(CDK)substrates〔J〕.Biosci Rep，2010；30(4):243-55.

2Gopinathan L，Ratnacaram CK，Kaldis P.Established and novel Cdk/cyclin complexes regulating the cell cycle and development〔J〕.Results Probl Cell Differ，2011；53(11):365-73.

3袁春意,谢 琼.丹参酮ⅡA在肿瘤领域的实验研究进展〔J〕.中医药导报,2009；15(9):67-9.

4张 萌,钱亦华,唐安琪.丹参酮ⅡA药理作用的研究进展〔J〕.医学综述,2010；16(17)：2661-4.

5李 健,武 彪,李映良.丹参酮ⅡA对人乳腺癌细胞MDA-MB-231作用的实验研究〔J〕.军医进修学院学报,2012；33(7)：754-6.

6王江峰,周卸来,袁 红,等.丹参酮A对人肺癌细胞株A549/CDDP细胞增殖和凋亡的影响〔J〕.实用肿瘤杂志,2010；25(6):684-8.