骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊神经急性损伤的疗效

李 真

(河南理工大学体育学院人体科学实验室，河南 焦作 454000)

基础研究证实，哺乳动物的脊髓神经损伤后，通过内源性修复产生的新生神经细胞极少，也难以启动功能性轴突再生〔1〕，所以后期康复较难。近年来通过骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植以及神经组织工程的发展为脊髓损伤的治疗开辟了一条新途径。间充质干细胞(MSC)是一种存在于骨髓等多种组织中的具有多向分化能力的干细胞，具有很强的可塑性及趋化性，可以移行进入组织，在适宜条件下可分化成为多种中胚层来源的组织细胞〔2〕，以诱导细胞的再生和生长，对受损组织进行修复。在BMSCs移植干预治疗脊神经损伤反面，张殿君等〔3〕研究指出，把有特定分化潜能的神经前体细胞移植治疗中枢神经系统损伤以及各种神经退行性疾病，可以促进患者神经功能恢复。本研究观察BMSCs移植治疗脊髓神经急性损伤大鼠的疗效。

1 材料与方法

1.1实验材料 Wistar健康大鼠(购自郑州大学医学院动物饲养中心)，清洁级，雄性，体重(160±14)g，8～10周龄，两组大鼠模型由专人统一分笼饲养和料理(动物房合格证号：豫医动字第4104022号)，室内通风良好，室温控制在24℃左右，每日两次对大鼠进行清理和消毒，避免伤口感染，每8 h对大鼠喂食一次，食量以大鼠自由进食为主配以针管经口腔注喂流体食物为辅，大鼠于护理期间无死亡；流式细胞仪(美国BD公司)；CO2孵箱(日本SANYO)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青)；SP试剂盒(北京中杉金桥)；神经生长因子(NGF)与脑源性神经营养因子(BDNF)抗体(Santa Cruz公司)等。

1.2MSCs分离、培养和标记 取Wistar健康大鼠1只，雄性，体重168.9 g，9周龄。无菌条件下分离大鼠双侧股骨，采集骨髓，贴壁法分离BMSCs，接种于25 cm2塑料瓶，加L-DMEM及体积分数10%胎牛血清，于37℃、体积分数5%的CO2孵育箱内培养，24 h后换液，去除未贴壁细胞，以后每3～5天换液1次，待细胞80%融合时用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，如此反复换液、消化，至第7代细胞。取第7代细胞，于培养液中加入Brdu进行标记，使其终浓度为15 μg/ml。将标记好的BMSCs用胰酶消化(37℃，5 min)，使细胞游离后，加入含血清的新鲜培养基中止胰酶作用，弯头吸管轻轻吹打细胞，将吹打下来的细胞悬液转入离心管离心(1 500 r/min)，5 min，然后倒去上清，加入不完全培养基0.5～1 ml，重新悬浮细胞，并取30 μl进行台盼蓝细胞计数，细胞数约为5×104/μl。

1.3脊髓损伤模型的建立 取Wistar大鼠50只备用，清洁级，雄性，标记每只大鼠体重周龄。用特制椎板钳咬除实验动物T8及T9棘突及椎板，显露硬膜。使用动脉瘤夹子，直接钳夹T9段脊髓约0.5 s(操作方法：用改良的动脉瘤夹子尽量咬除T9段棘突及椎板，标定力量为35 g，用持夹器将动脉瘤夹打开，然后突然释放动脉瘤夹，使脊髓受到突然的暴力打击，打击用时约0.5 s，操作过程中确保动脉瘤夹的位置准确。相关研究指出〔4〕：该法能保持硬脊膜的完整性，且脊髓损伤后的解剖结构与神经功能的变化与挫伤型脊髓损伤非常相似，且力量从2 ～98 g过程中发现钳夹力越大，损伤区域残存的轴突越少，功能恢复越不理想。本研究标定力量为35 g，以快速挤压造成脊髓急性完全损伤，建立脊神经急性损伤模型。以鼠尾痉挛性摆动、双下肢瘫为损伤标准。选取造模成功进入实验动物40只，随机分成对照组和BMSCs移植组各20只，两组大鼠体重、周龄、下肢瘫痪程度等基本指标无显著性差异(P>0.05)。

1.4BMSCs移植 BMSCs移植组：脊髓损伤第7天和第28天，行第2次和第3次手术。暴露损伤脊髓，以微量注射器将含BMSCs(约为5×104/μl)的培养液5 μl缓慢注入脊髓损伤中心，3 min内推完，留针5 min，并用医用生物胶封闭针孔以防止细胞悬液外溢，逐层缝合伤口。对照组以模型组方法，注入等量生理盐水。

1.5后肢运动功能评估 采用BBB运动功能评分系统〔5〕将大鼠后肢运动分为22个等级，后肢全瘫为0分，完全正常为21分。分别在第2次手术后第1、2、3、4、6、8周，由同一实验人员连续对实验大鼠后肢运动功能进行单盲法评分。

1.6NGF和BDNF检测 8 w后，处死两组大鼠，开胸，经心灌注200 ml 4℃的生理盐水冲去血管中的血液，然后灌注4%的4℃的多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH7.2～7.4)500 ml。灌注固定30 min后，取损伤区T8及T9段脊髓放入4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液24 h以上，于切片前先天晚上在最接近横断处切下1 cm放入20%蔗糖溶液中4℃过夜，石蜡包埋，用恒冷切片机连续切片，片厚25 μm。疫组织化学染色严格按照试剂盒操作说明进行，以PBS代替一抗作阴性对照。每只大鼠随机取5张切片，运用图像分析卡(北京天地公司)，IBM586和Olympus Bx60显微镜组成的图像处理系统观测，计算阳性反应胞体的数量和各组NGF、BDNF阳性细胞的平均值。

1.7统计学处理 应用SPSS13.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1BBB评分结果 伤前各组BBB评分均为21分。伤后各组大鼠均表现为完全截瘫为0分。5 d后，对后腿针刺开始有回缩反应，但差异不显著(P>0.05)。于损伤第7天开始对两组进行移植后比较治疗，第2周后出现后肢运动，3 w后可见明显后肢活动，6 w后后肢活动趋于协调。伤后3～8 w后两组评分差异显著(P<0.05)，见表1。

表1 伤后两组大鼠后肢活动功能BBB评分(分，n=20,±s)

2.2NGF和BDNF蛋白检测结果 移植组NGF和BDNF蛋白表达量(97.14±7.52，265.82±6.15)明显高于对照组(35.26±4.71，112.34±5.74，P<0.05)。

3 讨 论

传统观点认为：中枢神经系统受损后造成大量神经元缺失时，因不能产生新的神经元，建立新的突触联系，而致损伤后的功能难于恢复〔6〕。

干细胞的发现改变了以往认为成年哺乳动物中枢神经神经元不能再生的认识〔7〕。Park等〔8〕将基因修饰的骨髓MSCs输注到健康雌鼠体内，通过建立帕金森病动物模型观察骨髓MSC对黑质细胞的保护作用，发现酪氨酸羟化酶免疫活性阳性的黑质神经元在治疗组明显高于对照组。Harvey等〔9〕研究认为，BMSCs可被诱导分化为神经元细胞和神经胶质细胞，迁移至病变部位，产生数种神经营养因子及其受体，可有助于损伤脊髓神经元的修复，抑制不利于神经再生的瘢痕形成。王振宇等〔10〕将经过碱性纤维细胞生长因子修饰的BMSCs移植到损伤脊髓内，发现可以极大地提高碱性纤维细胞生长因子的表达水平，并且能有效促进大鼠脊神经损伤后的运动功能恢复。神经干细胞可以通过连接脊髓损伤断端，建立新的突触联系，同时在损伤处分泌神经营养因子，改善脊髓损伤的微环境，促进髓鞘再生，恢复神经传导。因此干细胞移植成为了当前国际医学界关注的热点，为人类神经疾病的治疗带来了希望〔11〕。

NGF是一类已被证实的能够促进和维持神经生长、生存、分化和执行功能的特种蛋白，还可挽救损伤的神经元〔12〕。通过基因转移NGF的研究证实，在成年鼠脊髓损伤后，NGF能诱导感觉神经元和去甲肾上腺素能神经元轴突延伸，使病灶局部运动神经元纤维发芽〔13〕。外源性NGF注横断性脊髓损伤局部，可导致皮质脊髓束轴突的密度显著增高〔14〕。BDNF是神经营养因子家族中重要成员，它与NGF有50%同源性〔15〕，不仅在中枢神经系统发育过程中对维持神经元正常的生理功能等方面起重要作用，还可诱导神经突起定向生长，决定感觉和交感神经纤维的生长方向，同时具有运动神经纤维营养活性，能保护脊髓运动神经元在脊髓损伤后免于死亡。Li等〔16〕研究指出，BDNF对多种神经元的发育分化与生长再生具有维持和促进作用，还可阻止坐骨神经横切后大量运动神经元的死亡，且能挽救脊髓半切伤后的红核神经元。由此可见，NGF和BDNF是干预神经修复的机制的重要物质，对神经成长与修复的效果有着重要的影响，也就是说NGF和BDNF物质表达的好坏，可以直接影响着神经修复的效果。

脊神经损伤模型大鼠的腿部运动功能正与其脊神经的损伤有关，脊神经修复的好坏直接影响其腿部的运动功能。而NGF和BDNF是干预神经修复机制的重要物质，其充分表达可以促进脊神经损伤大鼠神经元的存活、再生及其脊神经的再生与修复，对神经是否能够得到良好成长与修复起着重要的影响与制约作用。本文说明BMSCs移植有利于NGF和BDNF蛋白的表达，而神经因子的显著表达有利于促进大鼠受损脊神经组织细胞的再生、成长与修复。所以，移植组大鼠腿部运动功能的康复更多的得益于BMSCs对NGF和BDNF的诱导进而促进其脊神经功能的修复。

4 参考文献

1张延洁,蔡 芳,杨一峰.中老年人骨髓间质干细胞的生物学特性研究〔J〕.中国生物工程杂志，2005；25(4)：33.

2Zhan H,Yan HL,Huan X.Functional recovery and microenvironmental alterations in a rat model of spinal cord injury following human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells transplantation〔J〕.中国神经再生研究(英文版),2010；5(3):165-8.

3张殿君,刘 一,付长峰,等.胰岛素样生长因子对脊髓源性神经干细胞定向分化的影响〔J〕.中国老年学杂志,2010；30(4):914-6.

4祖 波,尹宗生.机械性脊髓损伤模型的建立及其评价〔J〕.中国临床康复,2006；10(12):151-3.

5顾摇兵,金建波,李华南,等.脊髓损伤动物模型的运动功能评价〔J〕.中国药理学通报,2011；21(7):893-7.

6唐茜茜,崔元孝.干细胞移植在中枢神经系统疾病中的应用进展〔J〕.中国康复医学杂志,2011；26(7):609-12.

7诸葛栋,梁战华,宋 琳,等.不同来源干细胞神经向分化能力的研究现状〔J〕.中国组织工程研究与临床康复杂志,2010；14(32):6031-4.

8Park K,Eglitis MA，Mouradian MM.Protection of nigral neurons by GDNF-engineered marrow cells transplantation〔J〕.Neurosci Res，2001；40(4):315-23.

9Harvey RL,Chopp M.The therapeutic effects of cellular therapy for functional recovery after brain injury〔J〕.Phys Med Rehabil Clin N(Am),2003；12(1):143-51.

10王振宇,刘文革,黄朱宋.bFGF基因修饰骨髓间充质干细胞移植对急性脊髓损伤大鼠神经元的影响〔J〕.福建医药杂志,2010；32(6):8-10.

11杨艺敏,张 颖,冯加纯.神经再生与疾病关系的研究进展〔J〕.中国老年学杂志,2010；30(6):857-9.

12陈 良,刘 阳.骨髓基质干细胞移植对大鼠脊髓损伤区NGF与BDNF表达的影响〔J〕.四川医学，2011；32(3):320-2.

13Hu Y,Mao JH,Zhu Y,etal.Nerve growth factor pretreatment against glutamate-induced hippocampal neuronal injury Action mechanism of phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10〔J〕.中国神经再生研究(英文版),2010；5(1):5-9.

14Li XH,Liu NB,Zhang MH.Effects of chronic multiple stress on learning and memory and the expression of Fyn，BDNF，TrkB in the hippocampus of rats〔J〕.中华医学杂志(英文版),2007；120(8):669-70.

15Liu NB,Li H,Liu XQ,etal.Chronic multiple stress enhances learning and memory capability in rats〔J〕.Acta Physiol Sin,2004；56(5):615-9.

16Li SH,Li ZH,Wen HL.Construction of Ad-EGFP-BDNF vector and its expression in neural stem cells〔J〕.中国神经再生研究(英文版),2010；5(13):987-90.