大鼠颅脑损伤后MMP-2和MMP-9表达的变化及与损伤时间的关系

马 晨 刘晓智 刘振林

(天津市第五中心医院神经内科，天津 塘沽 300450)

创伤性颅脑损伤(TBI)是最常见的机械性损伤之一，原因包括道路交通事故损伤、高空坠落损伤和攻击损伤，极容易导致死亡，颅脑损伤占创伤总数15%，但死亡率却占创伤总数的85%〔1〕。基质金属蛋白酶(MMP)-2和-9又称基质溶素-1，主要由巨噬细胞、结缔组织细胞和肿瘤细胞生成。TBI导致血脑屏障损伤，MMP-2 和 MMP-9对TBI死亡细胞的清除扮演着重要的作用，是调节TBI损伤的重要细胞因子之一。本研究探讨大鼠颅脑损伤后MMP-2 和 MMP-9表达的变化及与损伤时间的关系。

1 材料与方法

1.1实验动物 选用健康成年SD大鼠96只，由本院中心实验室提供，体重(250±50)g，雌雄不分，置于安静、温暖、避强光的环境中分笼饲养。

1.2试剂和装置 试剂：MMP-2和MMP-9兔抗鼠单克隆抗体(购于凯基生物公司)，二抗、DEPC及SABC试剂盒、DAB显色剂等(购于上海生工生物公司)。装置：定向仪、PVC管、铁制砝码和铁质撞击小锤组成(由中心实验室提供)。FTC-2000 型实时荧光定量PCR仪(由中心实验室提供)。

1.3大鼠脑外伤模型建立

1.3.1实验动物分组 运用随机数列表，把大鼠随机分为A组(正常对照组)8只、B组(假损伤组)8只和C组(损伤组)80只。C组又分为10组,分别为C1组损伤后 (1 h)，C2组损伤后(6 h)，C3组损伤后(12 h)，C4组损伤后(24 h)，C5组损伤后(2 d)，C6组损伤后(3 d)，C7组损伤后(5 d)，C8组损伤后(7 d)，C9组损伤后(10 d)，C10组(14 d)共，每组8只。

1.3.2实验模型制作 将大鼠称重后吸入乙醚麻醉后，剪去顶部鼠毛，按照0.35 g/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉，消毒皮肤后，将大鼠固定于定向仪装置内，将撞击小锤放入骨窗内，沿中线切开头皮长约1.5～2.5 cm，分离骨膜，用牙科钻磨开颅骨，以前囟后1.5 mm、中心右侧2.5 mm为中心，形成直径5 mm骨窗，保持硬脑膜完整。将铁质砝码放入 PVC管并安装在立体定向仪上，经调节使铁质砝码底面恰与撞击小锤底面完全接触。悬吊40 g铁制砝码，使之自25 cm高处自导管内自由下落撞击小锤。撞击后即刻移开砝码，取出撞击小锤，压迫止血后用锌汀粉封闭骨窗，缝合头皮，置回鼠笼喂养。假损伤组只开窗不撞击，正常对照组不作任何处理。

1.4免疫组化染色 大鼠颅脑组织放入4%多聚甲醛溶液中固定，用PBS冲洗3次后，用羊血清孵育，MMP-9兔抗鼠单克隆抗体作为一抗，SABC法免疫组织化学染色，DAB显色均按说明书进行，苏木素复染，PBS作为阴性对照；另做常规HE染色。

对MMP-9免疫组化染色阳性反应物进行检测，各组阳性面积比及阳性反应物的平均光密度值。

1.5实时定量PCR测定MMP-2和MMP-9 mRNA表达量 取大鼠颅脑组织，冰生理盐水冲洗后迅速投入液氮中保存备用，用Trizol法提取总RNA(购于上海生工生物公司)，取大鼠脑组织50～100 mg，采用荧光实时定量RT-PCR技术对逆转录-扩增产物进行定量分析。MMP-2：正义：5’- GCTGATACTGACACTGGTACTG-3’，反义：5’-CAA TCTTTTCTGGGAGCTC-3’，运用探针：5’-GGAGCATGGCGATGGATACCCCTTTGACGGTAAGGAC GGACTCC-3’，长度217 bp。 MMP-9：正义：5’- CACCGCCAACTATGACCAGGA-3’，反义：5’-AAGACGAAGGGGAAGACGCAC-3’，运用探针：5’-FAM-ACTGTAACTGGGGGCAACTCGGCAGTA MRA-3’，长度280 bp，引物都是由上海生工生物公司合成。

1.6明胶酶谱分析MMP-2和MMP-9表达量 实验前配制明胶缓冲液:100 mmol/L CaCl2,200 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris和1 μmol/L ZnCl2；洗脱液:2.5% Triton X-100。取大鼠脑组织50～100 mg，匀浆、离心，组织蛋白抽提液,SDS-PAGE电泳用0.1%明胶的7.5%聚丙烯酰胺凝胶，用Marker作为对照。结束后用洗脱液漂洗，明胶缓冲液37℃孵育18 h,在缓冲液中加入EDTA 20 mmol/L、特异性抑制剂苯甲基磺酰胺20 mmol/L,以明确所得条带的性质。孵育结束后用考马斯亮蓝溶液染色1 h,脱色约45 min观察条带。

1.7统计学方法 采用统计软件SPSS17.0进行χ2及t检验。

2 结 果

2.1实验动物的一般表现 C组大鼠出现呼吸深快或暂停现象，出现全身轻度抽搐，同时出现去皮层综合征，如颈项强直、双侧前肢屈曲和下肢强直等。多数大鼠恢复后能自主呼吸，大约1 h可自主爬行；少数大鼠出现偏向偏瘫侧转圈运动，但在6 h内能恢复。A组和B组大鼠不出现上述症状，B组苏醒后恢复正常活动。

2.2MMP-2和MMP-9免疫组织化学染色结果 C组中,MMP-2和MMP-9阳性细胞在大脑皮层阳性细胞呈深棕黄色，位于神经元及胶质细胞的胞质内，表达量逐步增加，C1组出现阳性染色，但颜色较弱，主要为神经元；C2组染色程度与C3组差异无统计学意义，C4-C5组MMP-2和MMP-9神经元表达逐步增多，少量胶质细胞出现 MMP-9阳性染色；MMP-2在C7组染色强度达到高峰；MMP-9在C6组染色强度达到高峰；C7-C8组 MMP-2和MMP-9 阳性染色逐步减弱，C9～C10组MMP-2和MMP-9表达量逐步稳定。A组和B组中，MMP-2和MMP-9阳性细胞表达量极少,见图1、图2。

图1 MMP-2蛋白的表达变化(×400)

图2 MMP-9蛋白的表达变化(×400)

2.3MMP-2和MMP-9免疫组化分析 大鼠颅脑损伤后MMP-2和MMP-9平均光密度值与阳性面积比现出一个规律性变化，及升高-高峰期-逐渐下降期，A组与B组之间差异无统计学意义。MMP-2和MMP-9平均光密度值， C3组、 C4组、 C5组、 C6组、 C7组、 C8组、 C9组和 C10组与A组之间存在统计学意义(P<0.05)，损伤12 h后开始显著增强(与相邻上组比较P<0.05)，MMP-2在5 d左右达到高峰，到14 d维持在较高水平;MMP-9在3 d左右达到高峰， 到14 d维持在较高水平。对于MMP-2和MMP-9阳性面积比，颅脑损伤后C4组、C5组、C6组、C7组和C8组与A组之间存在统计学意义(P<0.05)，损伤1 d后开始显著增强(与相邻上组比较P<0.05)，MMP-2在5 d左右达到高峰,到7 d都维持在较高水平表达状态，在伤后10 d表达明显降低；MMP-9在3 d组时达到高峰，到5 d都维持在较高水平表达状态，在伤后7 d表达明显降低，具体见图3、图4。

与正常对照组比较:1)P<0.05；与上一组比较:2)P<0.05；下图同

图4 脑损伤后MMP-2、MMP-9阳性面积比的时相分布

2.4MMP-2和MMP-9 mRNA在各组的表达量 MMP-2和MMP-9 mRNA表达量呈现规律性变化：升高-高峰-下降期。MMP-2在C7组(5 d)出现最高峰，10 d都维持在较高水平表达状态，在伤后10 d表达明显降低；MMP-9在C6组(3 d)出现最高峰，7 d都维持在较高水平表达状态，在伤后7 d表达明显降低，见图5。

图5 MMP-2、MMP-9 mRNA在各组的表达量

2.5明胶酶谱分析MMP-2和MMP-9表达量 MMP-2和MMP-9分子量分别为：64、83 kD；发现表达量现规律性变化：升高-高峰-下降期。MMP-2在C7组(5 d)出现最高峰，10 d都维持在较高水平表达状态，在伤后10 d表达明显降低；MMP-9在C6组(3 d)出现最高峰，7 d都维持在较高水平表达状态，在伤后7 d表达明显降低，见图6。

图6 明胶酶谱分析MMP-2和MMP-9表达量

3 讨 论

TBI的神经细胞损伤机制可能包括血脑屏障结构与功能受损、损伤后相关蛋白生成不足及细胞凋亡〔2〕。细胞凋亡是指在某些刺激诱导下，机体细胞膜信号被激活，启动调控细胞凋亡的基因，导致细胞破坏或死亡。凋亡可能是通过启动减少细胞坏死，使细胞死亡变成主动清除〔3〕。TBI后血脑屏障破坏的机制：由于外力的直接作用造成毛细血管破裂，导致血管内皮细胞缺血坏死，血脑屏障完全受损，发生不可逆损害，起初仅为部分性损伤，但以后数小时至数天内会有许多继发性损害〔4〕。

本次研究发现，损伤后6 h出现了血脑屏障结构的破坏和脑水肿，出现毛细血管扩张,组织水肿、淤血和出血，脑组织出现炎症。损伤1 d后神经细胞水肿，血管扩大，胞质空泡形成；3 d后损伤区脑组织出现坏死，神经胶质细胞和组织间隙出现明显水肿现象，出现重度缺血性改变，发生继发性脑损伤。

MMPs是一种锌依赖性降解蛋白酶，可以降解细胞外基质分子，主要参与血管再生、炎症反应等过程〔5〕。MMP-2和MMP-9是基质金属蛋白酶，又称基质溶素、前明胶酶，在细胞内以前体形式存在〔6〕。MMP-2和MMP-9作用广泛，常由结缔组织细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞产生，能降解纤维连接蛋白及Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ、Ⅹ型胶原等生成，在颅脑损伤后一系列病理生理过程中具有重要的调节作用，在血脑屏障开放、细胞凋亡、炎症反应、损伤修复和细胞外基质重建等过程中发挥作用〔7〕。

本实验证明在神经元组织中，血脑屏障完整时MMP-2和MMP-9表达极少量，在颅脑硬膜外损伤后，血脑屏障中MMP-2和MMP-9起到重要的积极保护作用。随着血脑屏障结构和功能修复，7 d后脑水肿和继发性脑缺血缺氧逐渐减轻，改变了这种恶性循环，MMP-2和MMP-9的表达逐渐恢复正常。

4 参考文献

1Peskind ER, Brody D, Cernak I,etal. Military- and sports-related mild traumatic brain injury: an overview〔J〕. J Clin Psychiatry,2013;74(8):e17.

2Walker Buck P, Spencer Sagrati J, Shapiro Kirzner R. Mild traumatic brain injury: a place for social work〔J〕. Soc Work Health Care, 2013;52(8):741-51.

3李志恒,胡雪峰,金茂强.大鼠颅脑损伤后Caspase-9的表达变化及其法医学意义〔J〕. 新疆医科大学学报,2012;35(3):334-8.

4Mak CH, Wong SK, Wong GK,etal. Traumatic brain injury in the elderly: is it as bad as we think〔J〕? Curr Transl Geriatr Exp Gerontol Rep,2012;1:171-8.

5李刚莲，刘群英，夏 鹏,等. 大鼠皮肤MMP-2，MMP-9表达与损伤时间相关性的实验研究〔J〕. 重庆医科大学学报，2009;34(6)：698-701.

6Vázquez-Solís MG, Villa-Manzano AI, Sánchez-Mosco DI,etal. Prognosis in pediatric traumatic brain injury. A dynamic cohort study〔J〕. Rev Med Inst Mex Seguro Soc, 2013;51(4):372-7.

7Fuller GW, Woodford M, Lawrence T,etal. The accuracy of alternative triage rules for identification of significant traumatic brain injury: a diagnostic cohort study〔J〕. Emerg Med J,2013;30(10):876.