131I标记槲皮素的方法

魏 凯 李 悦 张苗苗 王 博 崔亚利

(哈尔滨医科大学附属第三临床医学院，黑龙江 哈尔滨 150081)

131I是治疗分化型甲状腺癌最特异、最有效的放射性药物，可以被甲状腺组织高选择性地吸收，疗效确切。然而，在分化型甲状腺癌的病变进展过程中，细胞可以出现失分化现象。研究指出，在分化型甲状腺癌转移的患者中，约有1/3可能发生失分化〔1〕。失分化使患者摄碘能力减低或丧失，使131I治疗无效，成为困扰医生及患者亟待解决的问题。槲皮素可以诱导肿瘤细胞凋亡，使失分化及未分化甲状腺癌再分化，且对放疗具有增敏作用。本文拟用131I标记槲皮素，以期寻找一种新的靶向药物可以提高甲状腺癌内放疗的疗效，减少失分化的发生，且达到对失分化及未分化的甲状腺癌行再分化治疗的目的。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂与细胞 槲皮素二水合物(美国Sigma 公司产品)，Na131I溶液(成都中核高通同位素股份有限公司)；氯胺T(Ch-T)，焦亚硫酸钠，甲醇，去离子水，玻板，氧化铝，微-晶纤维素，磷酸盐缓冲液(PBS)均购自北京化学试剂公司；甲状腺癌细胞FTC-133/8505C,美国实验室惠赠。

1.1.2仪器 CRC-15BETA 放射性活度计(美国 Capintec 公司)，SN-695B 型放免 γ 测量仪(上海核所日环光电仪器有限公司)，酶标仪(美国 Thermo 公司)，离心机(德国 Hettich Zentrifugen公司)，电子细胞数计数器(美国Beckman Coulter公司)，电子分析天平(德国Sartorius公司)， 薄层放射性扫描仪(瑞士CAMAG公司)。

1.2方法

1.2.1131I标记槲皮素的制备 应用氯胺T法对槲皮素行131I标记，取50 μg槲皮素溶于10 μl酸性甲醇中，待槲皮素完全溶解后与20 mBq Na131I溶液混合，然后加入Ch-T，充分混匀，室温静置30 min后用偏重亚硫酸钠溶液终止反应，标记完成。在对131I标记槲皮素的方法学探讨中，改变标记条件，选定5个影响标记结果的重要因素并分别选取不同的水平：氯胺T用量5～45 μg；槲皮素用量40～140 μg：反应体系的pH 2.0～11.0；反应温度4℃～37℃；反应时间1～30 min，分别测定标记率。经3次水洗，131I-Qu从游离131I中被纯化。离心分离后，游离131I从水溶液中去除。平行试验中，在同等条件下，样品中没有Ch-T被用于131I与槲皮素的任何反应中，作为空白对照组。

1.2.2质量控制 应用两种不同的薄层色谱法(TCL)作质量控制：一种是TCL氧化铝片(F254中性)，用甲醇作为流动相，另一种是TLC纤维素薄片，用甲醇-乙醚(20～80 V/V %)作为流动相。

1.2.3体外稳定性测定 将标记物投入到1 ml人新鲜血清中，置于37℃水浴箱中温育，分别测定标记物标记后24 h内1、2、4、8、24 h不同时间点的放化纯度。

1.2.4131I-Qu的结合率测定 采用细胞免疫结合率测定法测定131I-Qu的免疫活性。取对数生长期的甲状腺癌细胞(FTC-133/8505C)，制成 1×106、5×106、1×107、5×107、1×108/ml的细胞悬液，取0.05 ml置于微量离心管，4个复管。加入20 μl经PBS稀释的131I-Qu，混匀后4℃放置4 h，γ测量仪测总放射性活性T，然后低温离心5 min(2 000 r/min)，磷PBS洗3次，测定沉淀细胞的放射性活性B，计算结合率(免疫结合率=B/T×100)。对照组中加入游离的131I，其余步骤同上。

2 结 果

2.1131I标记槲皮素的标记条件 对照组未加入Ch-T纯化，沉淀物中未检测到放射性活性。

2.1.1Ch-T用量对标记率的影响 在固定槲皮素用量100 μg，pH6.0，室温和反应时间为5 min的情况下，131I-Qu的标记率随Ch-T用量增加而增加；当Ch-T为25 μg时，标记率可达(98.3±0.4)%，放化纯可达(98.8±0.3)%。但当Ch-T用量增加至30 μg时，标记率下降，为(85.4+0.5)%，两者差异有统计学意义(F=42.7，P<0.01)。见图1。

2.1.2槲皮素用量对标记率的影响 在Ch-T用量25 μg，pH6.0，室温条件下反应5 min，当槲皮素量为40～80 μg时，随着槲皮素用量的增加，标记率亦在增加；当槲皮素用量达到约82 μg时，标记率几乎已经达到最高。但为了能得到较高的标记率，因此，本实验中槲皮素用量为100 μg。见图2。

2.1.3pH值对标记率的影响 在固定Ch-T用量25 μg，槲皮素用量100 μg，室温条件下反应5 min，当pH6.0时，得到了最高的标记率，当pH<6.0时标记率随着pH值的减小明显下降，当pH>6.0时标记率随着pH值的升高亦明显下降。见图3。

图1 Ch-T用量对标记率的影响

图2 槲皮素用量对标记率的影响

图3 pH值对标记率的影响

2.1.4反应时间及反应温度对标记率的影响 将反应时间设为1、5、10 min，标记率分别为(98.1±0.6)%、(98.2±0.2)%、(98.16±0.3)%，组间差异无统计学意义(F=0.25，P>0.05)。将反应温度设定为4℃、室温37℃时，其标记率分别为(97.5±1.2)%、(98.3±1.0)%、(97.6±1.4)%，组间差异无统计学意义(F=0.06，P>0.05)。

2.2质量控制 应用两个薄层色谱系统，薄层色谱中应用氧化铝(Al2O3)和纤维素作为固定相，为131I-Qu和游离131I执行质量控制,效果良好。图4为一个典型的结果，应用两个薄层系统在125I -Q (A和C)和空白反应(B和D)。

A：应用TCL，Al2O3，第一峰为131I-Qu，第二峰为游离131I；B：应用TCL，Al2O3，出现锋为游离131I；C：应用TCL，纤维素，第一峰为游离131I，第二峰为131I-Qu；D：应用TCL，纤维素，第一峰为游离131I

2.3131I标记槲皮素的体外稳定性131I-Qu在 37℃条件下放置，见图标记物于1、2、4、8、24 h放化纯度分别为96.2%，95.9%、94.6%、93.3%、90.6%，测得放射化学纯度随时间逐渐呈缓慢下降趋势，至 24 h时所测值仍大于90%，说明131I-Qu体外稳定性良好。

2.4131I-Qu的结合率测定131I-Qu 的细胞结合率中 5×104、2.5×105、5×105个细胞组与 2.5×106、5×106个细胞组间差异有统计学意义(P<0.01)，5×104、2.5×105、5×105个细胞组间差异无统计学意义(P>0.05)，2.5×106、5×106个细胞组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 131I-Qu与FTC-133/8505C细胞的结合率±s,n=3,%)

3 讨 论

用放射性核素标记配体(如肿瘤血管靶向性肽、抗体或小分子化合物等)作为示踪剂，使之与高表达的受体分子结合，从而使肿瘤显像并对肿瘤细胞进行杀伤〔2〕。此外，与单独化疗药相比，将其与肿瘤导向治疗药物联合，可以达到增强肿瘤治疗疗效、降低药物毒性和不良反应的目的〔3〕。

放射性核素131I早于1984年就开始运用于导向治疗研究，既可应用于甲状腺疾病的诊断及特异性靶向治疗，还可应用于抗体、配体和反义核苷酸等的标记。本实验利用放射性核素131I标记，其优势在于：具有适宜的半衰期(8.02 d)；适宜的衰变能量；131I 释放的β射线能量为 607 kev，其杀伤半径大于50个细胞，可用于放射性核素内照射治疗；131I 还释放能量为 364 kev的γ射线，可作为示踪剂用于放射性核素显像。

本实验采用氯胺-T 法利用131I标记槲皮素。标记物分子结构较稳定，反应温和。标记产物131I -Qu的标记率较高，在37℃条件下其放射化学纯度仍然大于90% ，表明131I -QU 结合较稳固，脱碘不明显，具有良好的稳定性，有利于后期的实验研究。

放射性131I标记多肽的标记率受到很多因素的影响，但多肽分子中酪氨酸残基数目的多少、多肽分子中酪氨酸残基暴露的程度是最主要的因素。此外，影响标记反应的因素还包括(1)放射性碘的选用〔4〕：应选用新鲜的、比放射活度高的、无载体的、含还原剂量少的。(2)放射性碘与抗体用量的比例〔5〕：二者的比例会严重影响标记结果，一般情况下不应该投入过多的碘源，通常当投入的碘量一定时，抗体用量越多，碘的利用率越高，但得到的标记化合物比放射活度低；相反情况，抗体用量越少，那么碘的利用率则降低，但所得标记化合物比放射性则高，比放射活度会随此比值变化有较大的变动。(3)Ch-T的用量及碘化反应时间〔4〕：早期用氯胺 T 法作碘化标记时，一般Ch-T用量都比较大，致使严重毁伤了抗体结构和生物学活性。大量应用氯胺 T 是无益于实验的，其结果可能反而导致标记化合物活性下降。当然，也不能盲目减少Ch-T的用量，否则碘源中还原剂量过多，将会导致标记实验失败。许多标记试验中可以采取延长反应时间的方法提高标记率，但是氯胺T碘化法中一定要严格控制反应时间，反应时间过长会导致标记的多肽或抗体严重失活，理论上来讲，碘化反应时间通常在1 min，但是根据我们的实验，5 min时反应体系的标记率较高，低于5 min时，所得的标记率及放化纯都不甚理想。(4)根据不同化合物的性质决定多肽的pH值、酸、碱的反应条件〔6〕，反应温度和反应时间也是标记率的重要影响因素，时间太短,不完整,标记率很低；时间太长,容易破坏标记物的生物活性。

薄层色谱法是一种微量、简便、快速的分离方法，适用于微量样品的分离、鉴定和制备。

槲皮素是一种天然黄酮，广泛存在于植物的花、叶、果实中，生物学活性及药理作用广泛，具有抗氧化、有抗炎、降糖降压、免疫调节等作用，并且可抑制多种肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡〔7〕。本课题组已经证实〔8〕，在体内外实验中槲皮素均可以提高放疗的敏感性,其机制可能与靶向作用于ATM介导的放疗反应通路有关。

本研究显示，采用氯胺T法131I标记槲皮素的方法是可行的，在最佳标记条件下，其标记率和放化纯均>95%，方法简单，克服了间接标记需对槲皮素进行化学修饰及对其功能基团进行保护和去保护处理等不足，标记产物体外稳定性好，与细胞结合率较好。因此，131I -Qu是一种具有潜在应用价值的靶向新型抗肿瘤治疗药物。

4 参考文献

1Simon D,KoehrleJ,Reiners C,etal.Redifferentiation therapy with retinoid therapeutic option for advanced follicular and papil-lary carcinoma〔J〕.Wold J Surg,1998;22(6):569-74.

2Day AJ, Williamson G. Biomarkers for exposure to dietary flavonoids: a review of the current evidence for identification of quercetin glycosides in plasma〔J〕. Br J Nutr,2001;86:S105-10.

3Harwood M, Nielewska-Nikiel B, Borzelleca JF,etal. A critical review of the data related to the safety of quercetin and lack of evidence of in vivo toxicity, including lack of genotoxic/carcinogenic properties〔J〕.Food Chem Toxicol,2007;45:2179-205.

4Fahlman BM, Krol ES. Inhibition of UVA and UVB radiation-induced lipid oxidation by quercetin〔J〕. J Agric Food Chem,2009;57:5301-5.

5Benkovic V, Knezevic AH, Dikic D,etal.Radioprotective effects of quercetin and ethanolic extract of propolis in Gamma-irradiated mice〔J〕. Arh Hig Rada Toksikol,2009;60:129-38.

6Benkovic V, Kopjar N, Horvat KA,etal. Evaluation of radioprotective effects of propolis and quercetin on human white blood cells in vitro〔J〕. Biol Pharm Bull,2008;31:1778-85.

7张 杰，吕 蔡，张平安，等.槲皮素抑制人宫颈癌Hela细胞增殖的实验研究〔J〕.中国肿瘤临床，2006;33(8)：436-8.

8Hosseinimehr SJ, Tolmachev V, Stenerlöw B.125I-labeled quercetin as a novel DNA-targeted radiotracer〔J〕. Cancer Bioth Radiopharm,2011;26(4):469-75.