肝细胞肝癌NTS的表达与炎症微环境形成和肿瘤上皮间质转化及预后的关系

李 凯 杨锁萍 丁为民

(南方医科大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)

肝细胞肝癌〔1, 2〕(HCC)是一种高死亡率的原发性肝癌。虽然对于早期HCC的治疗采用手术切除治疗有效，但术后复发率亦很高，主要原因是HCC的侵袭性较高，并且向肝内外转移。有研究表明，肝脏炎症和纤维化环境在HCC的发生中具有重大的影响，并且学者们对炎症微环境〔3〕在促进肿瘤转移和侵袭中发挥的作用也越来越关注。有研究证实，慢性炎症和神经降压素/白介素-8(NTS/IL-8)炎症通路活化介导的炎症反应能通过诱导上皮间质转化(EMT)促使结肠癌和乳腺癌转移侵袭〔4〕。本研究使用免疫组织化学法检测NTS、炎症相关因子以及EMT相关蛋白，旨在探讨NTS和炎症微环境在HCC转移侵袭转移中的作用及预后的参考意义。

1 资料与方法

1.1对象选择 选择2011年8月至2013年10月来我院通过部分肝切除术术后病理确诊为HCC患者78例，回顾性分析所有患者的资料，其中男42例，女36例；平均年龄(66.25±5.26)岁。患者临床分期，36例Ⅰ期、22例Ⅱ期和20例Ⅲ期；按HBV感染分有45例无感染的，33例感染者；按有无饮酒史分为有21例无饮酒而56例有饮酒史的。所有患者术前均未接受其他放化疗。术后进行随访24～38个月。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学法〔5〕每个样品均经过常规脱蜡、修复抗原、去内源性过氧化物酶和牛血清蛋白封闭，然后将准备好的单克隆抗体(IL-8)、 基质金属蛋白酶9(MMP-9)、上皮细胞钙黏蛋白(E-Cadherin)、β-连环蛋白(β-Catenin)和波形蛋白(Vimentin)滴上，4℃下过夜充分结合，37℃下二抗反应30 min，二氨基联苯胺(DAB)显色，用苏木精复染。空白处理，磷酸盐缓冲液(PBS)取代一抗作为对照。所有样品在光学显微镜下观察。每例标本随机选择10个400倍镜视野，每个视野计数100个细胞。

1.2.2评价指标 细胞染色阳性率(PR)，染色阳性细胞所占的比例，阳性细胞为细胞质或膜出现棕黄色颗粒，范围0～3，分别对应≤10%、11%～30%、31%～60%和>60%。同时，按着色强弱，0～3表示无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色。蛋白低表达/不表达为这两种评定方法合计分少于4分，否则为蛋白高表达。

1.3统计学方法 应用SPSS17.0软件，计数资料使用χ2检验；计量资料两组间比较使用t检验；多组采用方差分析；相关分析采用Spearman秩相关。

2 结 果

2.1NTS的表达和炎症相关蛋白的情况 78例患者肝癌组织细胞质中棕黄色颗粒NTS的表达阳性率是19.23%，15例标本中NTS平均PR是(50.06±10.19)%；IL-8的表达阳性率是55.13%，43例标本中NTS平均PR是(50.76±11.58)%；MMP-9表达阳性率是44.87%，平均PR(46.32±13.77)%，而VEGF的表达阳性率48.72%，平均PR(43.81±15.25)%。NTS阳性的标本中有86.67%(13/15)表达IL-8，而NTS阴性的标本中仅有47.62%(30/63)表达IL-8，且NTS与IL-8表达存在正相关关系(Rs=0.296,P=0.006)，HCC患者中NTS阳性组IL-8、MMP-9和VEGF的表达均显著高于阴性组(P<0.05)。见表1。

2.2NTS的表达和EMT相关蛋白的情况 通过观察NTS和IL-8表达均阳性的肝癌样本，发现膜E-Cadherin丢失表达，而细胞质中β-Catenin和Vimentin增加积累。经过相关性分析发现，肝癌患者组织中的E-Cadherin和β-Catenin表达与IL-8表达水平存在关联(R=0.302，0.259，P=0.302，0.031)，显示在HCC中，NTS/IL-8炎症通路的异常活化导致升高表达的IL-8可能引起EMT。

表1 不同NTS表达组的IL-8、MMP-9和VEGF表达情况±s,%)

2.3NTS的表达与HCC患者预后的关系 78例HCC患者在不同乙型肝炎病毒(HBV)感染、饮酒史和临床分期之间的总生存期OS差异无统计学意义(P>0.05)，然而，对NTS和IL-8进行单因素分析发现，两组对患者的生存期存在重要影响，NTS阳性组和IL-8阳性组患者生存期均短于阴性组(P<0.001)。见表2。

表2 HCC患者不同临床参数对生存的影响±s)

3 讨 论

HCC是全球最为常见的致死性恶性肿瘤之一，导致HCC发病的主要危险因子有饮酒、肝炎病毒、黄曲霉素B1摄入等〔6〕。由于我国是乙型肝炎高发区域，因而也是HBV相关性HCC的高发地区，HCC在我国的发病率位居前列。随着社会和科学技术的发展，人类对HCC的发病机制、诊断技术及治疗方法也取得一定的进步。但是对于大部分HCC患者来说，由于缺乏有效的早期诊断和病程判断的标志物往往确诊后已失去手术机会，且术后复发转移的概率较大，极差的预后。近年来，有研究报道，约80%的HCC患者发生在病毒性肝炎引起的慢性炎症和肝硬化的前提下，提示肝脏炎症微环境对HCC的发生及发展起到重要作用〔3,7〕。文献表明，NST作为一个含有13个氨基酸的神经肽，它也是给恶性肿瘤提供生长信号的一种神经内分泌肽〔8〕。另外，有研究者支持，EMT不仅与肿瘤的转移和侵袭密切相关，还能促使肿瘤细胞获得干细胞的特征，进而影响到肿瘤的预后〔9,10〕。

本研究提示NTS/ IL-8炎症通路的活化促进肿瘤微环境中释放多种炎症因子。文献报道，NTS在正常成熟的肝脏和原发性肝癌组织中不表达，在胎儿肝脏短暂表达〔11,12〕。本研究的结果意味着在一些肝癌标本中存在NST异位表达，这与以往的研究结果一致。同时，提示NTS/ IL-8炎症通路的异常活化导致升高表达的IL-8可能引起EMT。EMT是一个上皮细胞经过多次生化变化的生物过程，可具有一个间质表型，这个表型是上皮源性癌症复发和转移的重要分子基础〔13〕。本研究还发现NTS和IL-8对患者的生存期存在重要影响，提示NTS/ IL-8炎症通路的异常激活影响患者术后预后效果，这可能是通路活化引起慢性炎症和EMT的原因，最后引起HCC转移和侵袭增加。

综上所述，在HCC患者中存在NTS/ IL-8炎症通路的异常激活，NTS的表达与炎症微环境形成能促进肿瘤上皮间质转化及对患者预后产生不良影响。

4 参考文献

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13孙 斌,殷正丰.肝癌细胞的上皮间质转化〔J〕.中华肿瘤杂志,2012;34(10):721-4.