ET-1基因多态性与海南黎族人原发性高血压的相关性

王 镇 张 勇 吴 恳 金水晶 苏 娅 周代峰 邱逸敏 黄 玲 晏辉芳

(海南省干部疗养院，海南 海口 571100)

原发性高血压(EH)是遗传与环境因素交互作用的结果。内皮素-1(ET-1)是由血管内皮细胞分泌的血管收缩肽，也是迄今所致人体内最强烈的血管收缩剂，参与许多疾病的发生发展过程。近些年来研究发现该基因与EH的发生密切相关。基因多态性是形成个体差异的遗传基础，也是很多疾病发生的遗传基础。获得ET-1基因多态性与EH的关联性，对EH的防治具有重要意义。国内外有许多学者对ET-1基因多态性与高血压相关性进行研究，但是研究结果因不同种族不同地区人群及不同研究方法有差异。本研究拟探讨ET-1基因的三个多态性位点ET-1+138A/-、 K198N、G8002A与海南黎族EH的相关性。

1 对象和方法

1.1对象 EH组：随机选取2010～2013年于海南省老年病医院住院的海南籍黎族无血缘关系的EH病人98例，诊断符合1999年世界卫生组织(WHO)与国际高血压学会(ISH)和2004年中国高血压防治指南标准，即收缩压≥140 mmHg和(或)舒张压≥90 mmHg。所有入选者排除继发性高血压、冠心病、糖尿病、肿瘤及严重肝肾功能损害。正常血压对照组：随机选取海南籍黎族健康居民244例，无血缘关系和高血压家族史，排除冠心病，糖尿病，肿瘤，肝肾功损害者。

1.2方法

1.2.1引物的设计与合成 从GenBank中获得人类ET-1基因的DNA全序列和mRNA序列, 用PRIMER6.0 软件辅助设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。

1.2.2基因多态性检测 ①PCR 扩增：每个多态位点均设立2个PCR检测管,分别加入寡核苷酸正常和突变引物用于检测每个多态位点正常和突变的等位基因。反应总体积为20 μl，反应体系如下：每管在1×PCR缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2)中含模板DNA 0.2 μg,引物各0.1～0.15 μmol/L，4种dNTP各200 μmol/L, Taq DNA聚合酶(康为世纪)1 U。加入1滴石蜡油覆盖。PCR循环条件为94℃30 s，56℃30 s，72℃50 s，最后在72℃延伸10 min。②序列测定：随机抽取经上述建立的等位基因特异性PCR技术检测后分型出的各种ET-1基因型的DNA样本，用测序引物对扩增包含有各突变位点的特异DNA片段，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA 序列测定。③基因分型：每种ET-1基因突变位点都利用突变型引物和野生型引物同时进行两管PCR扩增，根据每个样品两种等位基因扩增产物结果，可准确判定样品的基因类型。

表1 等位基因特异性PCR的引物序列及扩增片段长度

1.3统计学方法 基因频率采用基因计数法计算。研究对象与Hardy-Weinberg平衡的符合程度χ2及组间基因型与等位基因频率比较用χ2检验。采用SPSS16.0软件进行分析。

2 结 果

2.1ET-1基因三个多态位点的基因分型结果 在海南黎族人群中，K198N位点检测出了198GG、198GT和198TT三种基因型,G8002A位点检测出了8002GG、8002GA和8002AA三种基因型,+138A/-位点检测出了138(4A4A)、138(4A3A)和138(3A3A)三种基因型。K198N位点在高血压组和正常对照组间的差异达到显著水平(P<0.05)，+138A/-在组间的差异达到极显著水平(P<0.01)，而G8002A在组间的差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.2ET-1基因三个多态位点等位基因型检测结果 表3可见，K198N的G和T两个等位基因在高血压组和对照组间的分布频率无显著差异，G8002A位点的G和A两个等位基因的分布频率具有显著差异(P<0.05), +138A/-位点3A和4A两个等位基因的分布频率具有极显著的组间差异(P<0.01)。

表3 各组中ET-1基因三种多态位点的等位基因频率〔n(%)〕

3 讨 论

EH主要是由于患者血管张力的变化所致，而后者主要受到血管内皮细胞生成的各种血管收缩因子和血管舒张因子的拮抗所影响。在上述因子中血管紧张素Ⅱ、内皮素和NO三类因子的平衡最为重要，一旦该平衡被打破，就可能导致血管张力的改变进而导致EH的发生。ET-1主要位于血管内皮细胞和平滑肌细胞，是血管收缩最重要的控制因子，该因子与血压的升高呈正相关，因而被认为可将其浓度作为判断EH病情的指标〔3～5〕。EH-1的浓度及活性主要取决于基因的形式，而SNP作为最常见的基因突变形式，可能与高血压的发生密切相关。研究ET-1基因SNP位点多态性与原发性高血压的关联，可能为原发性高血压的诊断、预测及干预提供参考依据。ET-1的编码基因EDN1位于6p23-p24，目前已经发现该基因存在多态多态位点，例如转录起始部位1370TG，外显子1的+138A-，内含子1的+1932G/A，第198个密码子K198N，第4外显子的8000T/G等。本研究选取+138A/-、 K198N、G8002A 3个多态性位点作为研究对象。EH组中+138A/-位点4A3A基因型分别频率明显高于正常对照组，提示基因型4A3A可能是血压升高的一个危险因素。等位基因3A、4A在EH组分布频率显著高于正常对照组，说明海南籍黎族EH患者中4A型等位基因可能是血压升高的危险因素。

K198N(Lys198Asn)是ET-1基因第158号密码子中的G突变为T而导致了赖氨酸与天冬氨酸的转换，是目前文献中报道较多的多态位点〔6～8〕。海南籍黎族EH组K198N位点的GT基因型分布频率明显高于正常对照组。说明该位点基因型可能是黎族人群血压升高的危险因素，与报道白种人、日本人人群的基因型GT杂合型与血压相关符合〔7〕。

G8002A是第 4 个内含子上 G-A 转换突变位点。黎族EH组G8002A位点上的AA基因型高于正常对照组，进一步分析G8002A位点上的A等位基因分布频率高于正常对照组正常对照组提示A等位基因可能是黎族EH的危险因素。

综上，本研究选取的三个ET-1多态位点中，有两个位点的基因型出现了组间差异，对EH的预测有一定的参考价值。

4 参考文献

1Yanggisawa M，Kurihara H，Kimura S，etal. A novel potent vasoconsiction peptide produced by vascular endothelia cells〔J〕.Nature，1998；332(6163):411-5.

2任军生，姚加平.原发性高血压患者治疗前后血浆ET-1和血清NO、CGRP检测的临床意义〔J〕.放射免疫学杂志,2013;26(4)：403-4.

3Barton M.Reversal of proteinuric renal disease and the emerging role of endothelin〔J〕.Nat Clin Prac Nephrol,2008;4(9):490-501.

4Krum H,Viskoper RJ,Lacourciere Y,etal.The effect of an endothelin-receptor antagonist, bosentan, on blood pressure in patients with essential hypertension〔 J〕. N Engl J Med,1998;338(12):784-90.

5康建华,赵连友,张跃义.高血压病患者血浆内皮素的改变及其临床意义〔J〕.中国心血管杂志,2003;6(1)：209-10.

6Black HR, Bakris GL, Weber MA,etal. Efficacy and safety of darusetan in patients with resistant hypertension: results from a randomized, double-blind, placebo-controlled dose-ranging study〔J〕. J Clin Hypertens(Greenwich), 2007;9(10): 760-9.

7Tiret L,Poirier O,Hallet V,etal.The Lysl98Asn polymorphism in the endothelin-1 gene is associated with blood pressure in over weight people〔J〕.Hypertension,1999;33(5):1169-74.

8Barde N，Anne E，Herbiso N，etal.Association between the endothelin-1 gene Lys198 Asn polymorphism blood pressure and plasma endothelin-1 levels in normal and pre-eclamptic pregnancy 〔J〕.J Hypert，2001;19(10):1775-82.