老年帕金森病大鼠模型皮质中γ-氨基丁酸 A受体β亚基含量的变化

姚素艳 刘建生 金 涛 郑德宇

(辽宁医学院病理生理学教研室，辽宁 锦州 121001)

帕金森病(PD)是指由各种病因引起的中脑黑质致密部(SNc)的多巴胺能神经元渐进性变性缺失，导致SNc投射到纹状体(Str)神经末稍释放的多巴胺(DA)减少〔1，2〕。研究表明约50%的中枢神经突触部位以γ-氨基丁酸(GABA)为递质〔3，4〕，在人体大脑皮质、海马、丘脑、基底神经节和小脑中起重要作用，并对机体的多种功能具有调节作用。GABA受体属于受体门控通道超家族成员，其中GABA A受体主要分布于脑内。动物及人体内的 GABA受体由5个不同的亚单位组成，并且在分子的中心部位形成门控氯离子通道。β亚基具有GABA的结合位点，当GABA与突触后膜的GABA A 受体的β亚基结合后，使整个受体产生变构作用，打开氯离子通道，达到抑制突触后神经元的作用〔5，6〕。在PD状态下，黑质中GABA含量在某些核团升高，而在其他核团降低。在PD状态下，在基底节环路的核团中，GABA A受体β亚基的含量是否会随着GABA含量的变化而发生适应性的变化还没有明确的报道。本研究拟探讨PD模型中GABA A受体β亚基的分布范围及表达量是否存在变化。

1 材料和方法

1.1动物 40只雌性SD大鼠，230～240 g，12月龄， 辽宁医学院动物中心提供。

1.2方法

1.2.1PD大鼠模型的制作及检测 SD大鼠适应性饲养1 w后，应用托盘天平称重，用6%水合氯醛腹腔注射麻醉，按照文献〔7〕的方法向动物脑内注射6-羟基DA(6-OHDA)，制作PD模型。在术后的第7天，按5 ml/kg体重腹腔内注射盐酸阿朴吗啡溶液，注射5 min后开始记录PD模型大鼠的旋转情况。旋转次数规定：大鼠向注射6-OHDA的另一侧(右侧，即健侧)不改变方向旋转360°为1次。检测1次/w，每次的记录时间为40 min，连续检测8 w。一般认为，平均旋转次数≥7次/min可认为是成功的PD大鼠模型〔7〕。

1.2.2GABA A受体中β亚基的表达 选择连续检测8 w后成模的PD模型大鼠和正常SD大鼠，6%水合氯醛深度麻醉后应用150 ml生理盐水灌注以替换脑组织中的血液。灌注后断颈处死动物，并在冰上迅速分离脑组织，在解剖显微镜(上海光学仪器厂、XYH-4A)下分离出皮质和丘脑，称重备用。

1.2.2.1高压液相色谱分析测定组织匀浆中GABA含量 取称重好的脑组织，按照1 000 μl/100 mg加入匀浆液，充分研磨，4℃，14 000 r/min离心15 min，小心吸出上清至另一新的高压灭菌后的1.5 ml EP管中，再次离心收集上清，用0.45 μm滤膜过滤后收集滤液，应用高压液相色谱分析法(waters，2695)测定皮质匀浆中GABA的含量。

1.2.2.2皮质中GABA A受体中各β亚基mRNA的表达 取称重好的脑组织，直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，按照1 ml/50 mg组织的比例加入Trizol，常规提取脑组织中的总RNA。根据各β亚基的mRNA序列设计下列引物，应用RT-PCR方法检测脑组织中各β亚基mRNA的表达。见表1。

表1 RT-PCR 的引物设计

取扩增后的PCR产物5 μl与1 μl溴酚蓝混匀，加入0.1%琼脂糖凝胶中，100 V电压下电泳，观察溴酚蓝的位置，在紫外灯下拍照，将照片扫描后经自动电泳凝胶图像分析仪(MSD-2000)测定各个PCR条带的灰度值，计算各个条带的比灰度值。比灰度值=目的条带的灰度值/β-actin扩增条带的灰度值。

1.2.2.3皮质、丘脑中GABA A受体各β亚基的蛋白表达水平检测 脑组织称重后直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，重复研磨三次。按200 μl组织蛋白抽提试剂/40 mg研磨组织向研磨物中加入预冷的蛋白提取试剂，常规提取组织总蛋白。测定并调整蛋白浓度，取相同量的蛋白样品及标准marker上样，应用10%十二烷硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离样品后，将蛋白条带转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭后加入各个β亚基 的单克隆抗体4℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗体以结合一抗，室温孵育膜1 h，化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影；经自动电泳凝胶图像分析仪(MSD-2000) 测定各个亚基的表达条带与内参β-actin条带的比灰度值。比灰度值=目的基因的灰度值/β-actin的灰度值。

2 结 果

2.1PD动物模型脑组织内GABA含量的检测 模型侧皮质部位(左侧)〔(3.07±0.6)μmol/g组织〕与对照侧(右侧)〔(2.54±0.47)μmol/g组织〕及正常对照(左侧)〔(2.46±0.53)μmol/g组织〕相比，GABA的含量明显升高(P<0.05)。

2.2qRT-PCR方法检测GABA A受体中各β亚基的mRNA水平 在损伤侧皮质中β1亚基(P<0.05)、β2亚基(P<0.01)和β3亚基(P<0.01)的mRNA水平均较对照侧及正常对照组低，但β1亚基的含量明显低于β2亚基和β3亚基。见表2；图1。

β1：GABA A受体β1亚基；β2：GABA A受体β2亚基；β3：GABA A受体β3亚基；β：β-actin

Cortex损伤侧(左侧)对照侧(右侧)正常对照(左侧)β1亚基0.088±0.0420.108±0.0321)0.100±0.0241)β2亚基0.234±0.0743)0.305±0.0862)3)0.298±0.0432)3)β3亚基0.245±0.0543)0.309±0.0712)3)0.315±0.0262)3)

2.3PD大鼠模型皮质中GABA A受体各β亚基的蛋白表达水平 在皮质中，β2亚基和β3亚基的表达丰度明显高于β1亚基，三者与对照侧及正常对照侧皮质相比，表达量均有所降低(P<0.05，P<0.01)。见表3，图2。

Cortex损伤侧(左侧)对照侧(右侧)正常对照(左侧)β10.067±0.0200.092±0.0171)0.097±0.0111)β20.214±0.0533)0.279±0.0322)3)0.291±0.0312)3)β30.205±0.0323)0.253±0.0272)3)0.249±0.0353)3)

3 讨 论

在PD状态下，由于SNc DA氨能神经元的变性缺失，投射到纹状体的AD能神经元末梢释放的DA减少，纹状体中DA的含量降低，导致基底节环路中直接通路和间接通路的紊乱、失衡，从而引起一系列的PD症状〔8，9〕。而皮质对纹体具有调节的作用，在PD状态下，是否在皮质中也存在递质含量异常，进而加剧了基底节环路的紊乱？本研究结果说明在PD状态下，不仅仅是基底节环路的平衡被打破、神经递质异常的升高或降低均可引起环路中核团的异常兴奋或抑制；而且这种变化也出现在皮质中，引起皮质中抑制性神经递质GABA含量升高，也可能会导致皮质的兴奋性受到抑制，进而皮质对纹状体的调节作用减弱，加剧了PD的症状。

在脑内，GABA的受体主要是GABA A亚型。GABA A受体亚型有19种亚基，包括α1-6，β1-3，γ1-3，δ，ε，π，θ，和 ρ1-3亚基〔10，11〕。其中α亚基与GABA AR的调节物(如苯二氮卓类等药物和巴比妥类药物)结合后可以改变受体的构象，促进受体的β亚基与GABA结合而产生生物学效应。在中枢神经系统中，GABA A受体至少由一种α、β与γ2组成，其中α2β2γ2分布最广，在多数部位也存在受体共存的现象〔12，13〕。在本实验中，无论是从mRNA的水平，还是从蛋白质水平，均有证据表明皮质中存在GABA A受体共存的现象。此外，GABA A受体的β亚基1～3均有不同程度的降低，说明PD动物模型皮质中，GABA A受体的总量呈下降趋势。

在PD状态下，由于纹状体中DA的含量降低，导致在基底节神经环路的一些核团中神经递质的含量发生了变化，引起PD的症状。大脑皮质在整个基底节环路中起到调节、活化的作用，接受多个核团的纤维投射，既有兴奋性的投射，也有抑制性的投射〔14～16〕。本研究结果显示，在皮质中存在因神经递质含量升高而受体下调的现象。皮质中GABA含量及GABA受体含量的变化可能为PD的实验治疗提出了一个新的问题，也为本课题组今后PD治疗方面积累了重要的数据。

4 参考文献

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