Maspin和VEGF-C在大肠癌组织中的表达及其临床意义

吴国武 廖志东 黎佳全

大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，局部浸润、侵袭及淋巴道转移是影响大肠癌患者预后的重要因素。Maspin基因是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)超家族的成员之一，Maspin 蛋白能抑制肿瘤生长和转移，可作为肿瘤转移及预后评估的重要指标。而血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factors C，VEGF-C)作为特异性的淋巴管生长因子，与肿瘤的淋巴转移相关。目前有关大肠癌中Maspin蛋白的表达的研究尚不多，而大肠癌中Maspin与VEGF-C的关系，鲜见文献报道。本研究采用免疫组化法检测大肠癌组织中Maspin、VEGF-C的表达情况，探讨其在肿瘤发生、发展过程中的作用及两者之间的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2006年8月-2009年4月间在我院行根治性手术切除的大肠癌标本蜡块97例，每例大肠癌标本均留取相对应的癌旁正常大肠组织。所有病例均为初治患者，术前未进行放化疗，临床病理资料完整。97例中男性52例，女性45例；年龄37～69岁，中位年龄53岁。临床分期按Duke's分期：A、B期50例，C、D期47例。有淋巴结转移40例，无转移57例。病理类型均为腺癌。肿瘤分化程度：高分化54例，中低分化43例。以97例大肠癌标本为实验组，每例标本所对应的癌旁正常组织为对照组。

1.2 免疫组化染色

所有蜡块均行4 μm厚切片，Maspin蛋白检测采用Maxvision 免疫组化法，VEGF-C蛋白检测采用S-P法。浓缩型小鼠抗人Maspin单克隆抗体(EWA 24)、兔抗人VEGF-C多克隆抗体及通用型SP试剂盒、Maxvision试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司。方法按试剂盒说明要求进行，石蜡切片用高温高压法修复抗原，染色过程中均用试剂公司提供的阳性切片作阳性对照，用PBS 替代一抗作阴性对照，DAB 显色，苏木精复染。

1.3 结果判定

VEGF-C及Maspin蛋白均以肿瘤细胞质和(或) 核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，由2位病理医生在双盲状态下对免疫组化染色结果进行评价，每张切片随机观察5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，VEGF-C和Maspin的表达分别参照文献[1-2]进行阳性判断。

1.4 统计学处理

应用SPSS13.0对数据资料进行处理，计数资料用χ2检验，Maspin和VEGF-C的相关性分析采用Spearman相关系数，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Maspin、VEGF-C表达与临床病理特征的关系

Maspin蛋白在癌旁正常组织及癌组织中的阳性表达率分别为77.31%(75/97)、58.76%(57/97)，差异有统计学意义(P=0.006，χ2=7.68)。癌组织中Maspin表达与肿瘤大小、浸润深度、Duke's分期有关，而与性别、年龄、淋巴结状态、组织学分化程度无关，见表1。

VEGF-C蛋白在癌旁正常组织及癌组织中的阳性表达率分别为29.90%(29/97)、63.92%(62/97)，差异有统计学意义(P=0.000，χ2=22.54)。癌组织中VEGF-C表达与肿瘤浸润深度、淋巴结状态、Duke's分期有关，而与性别、年龄、组织学分化程度及肿瘤大小无关，见表1。

2.2 VEGF-C与Maspin表达的相关性

本组57例Maspin表达阳性的病例中有31例VEGF-C同时表达阳性，40例Maspin表达阴性的病例中，VEGF-C表达亦阴性者9例，双向有序列联卡方分析显示Maspin和VEGF-C的表达呈负相关(Spearman 相关系数γ=-0.310，P=0.002)，见表2。

表1 大肠癌中Maspin、VEGF-C表达与各临床病理因素的关系/例

表2 大肠癌中Maspin与VEGF-C表达的相关性/例

3 讨论

1994年Zou等[3]从人正常乳腺细胞中分离出1个基因，由于其编码的蛋白是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serin protease inhibitor,Serpin)超家族的成员，故又称作Maspin 基因(mammary serpin)。Maspin在乳腺、前列腺、卵巢、胃肠道等正常器官组织中呈高水平表达，而在相应恶性肿瘤进展过程中多表现为表达下调或不表达，提示Maspin可以作为肿瘤转移及预后评估的1个重要指标。大量研究表明，Maspin主要通过诱导细胞凋亡、降低肿瘤细胞的运动和侵袭能力、抑制新生血管形成以及增加细胞间黏附性等途径对肿瘤发挥抑制作用。

Maass等[4]对正常乳腺腺体、乳腺纤维囊性变、原位导管癌、浸润性癌进行免疫组化检测时发现，Maspin基因在正常乳腺良性病变中呈高表达，而在原位导管癌→侵袭性乳腺癌→淋巴结转移癌3个不同阶段，Maspin基因的表达呈明显下降趋势，提示Maspin基因的表达对乳腺肿瘤的发生发展及转移的形成有影响。邹纪东等[5]报道，下咽癌中Maspin蛋白的表达率仅为47.2%，显著低于喉良性病变的83.3%和喉癌前病变的70%，且与患者的淋巴结转移和预后相关。黄秋实等[2]对结肠癌的研究发现，Maspin的表达明显低于正常肠黏膜及腺瘤，且Maspin表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和Duke's分期相关。本研究结果与之类似，只有淋巴结阳性组的Maspin表达率明显低于淋巴结阴性组，但尚未达到统计学意义水平(P=0.059)，可能与样本量不够有一定关系。

VEGF-C是Joukov等[6]从人类前列腺癌细胞株PC-3的cDNA文库中克隆并分离出VEGF/PDGF家族的1个新成员。作为第1个被发现的特异性淋巴管内皮生长因子，VEGF-C通过与淋巴管内皮细胞表面的特异性抗体VEGFR-3结合，介导和启动受体的酪氨酸激酶信号系统，促进毛细淋巴管内皮细胞的分裂增殖、毛细淋巴管的扩张和数量增加，在肿瘤的淋巴管生成及淋巴结转移过程中具有关键性作用。

Maeda等[7]对221例T1期结、直肠癌标本的研究显示，VEGF-C阳性组淋巴结转移率较阴性组高，多因素分析则更显示VEGF-C是淋巴结转移的独立影响因素。帖晓静等[8]用原位杂交技术检测大肠癌组织中VEGF-C的mRNA表达，发现癌组织中VEGF-C 的 mRNA阳性表达率与Duke's分期、浸润深度和淋巴结转移密切相关(P<0.05)，且VEGF-C表达阳性者的淋巴管密度显著高于VEGF-C表达阴性者。刘涛等[1]则检测了82例中低位直肠癌的VEGF-C表达情况，结果与我们的研究基本一致，说明VEGF-C的高表达可促进肿瘤淋巴管生成，且与肿瘤的发展、区域淋巴结转移以及预后密切相关。

VEGF-C作为最重要的淋巴管生成因子，其与Maspin的关系目前文献报道不多，Zhang等[9]最近报道，通过慢病毒载体介导的RNA干扰技术敲除膀胱癌T24细胞的VEGF-C表达，再进行双向差异凝胶电泳法(2D-DIGE)蛋白质组学分析，发现Maspin的表达显著上调。邹纪东等[5]的研究也证实，Maspin阳性的下咽癌淋巴管密度(LVD)明显低于阴性组，呈明显负相关性，并认为Maspin可能是通过抑制淋巴管生成抑制肿瘤淋巴结转移。有关胃癌[10]的研究也发现在蛋白质水平的表达上，VEGF-C与Maspin呈负相关，和我们的结果一致。

综上，我们认为大肠癌中存在着VEGF-C过度表达及Maspin表达下调或缺失的情况，与肿瘤的发生、发展及生物学行为密切相关，且Maspin与VEGF-C的表达呈负相关，两者有可能作为大肠癌的发生、发展及预后的判断指标。

[1] 刘 涛，张 超，吕 伟，等.VEGF-C在直肠癌中的表达与临床病理特征的关系〔J〕.中华普通外科杂志2010，25(4)：306-308.

[2] 黄秋实，史成章，王红建，等.Maspin蛋白及uPA在结肠癌组织中的表达及其临床意义〔J〕.实用肿瘤学杂志 2008，22(3)：220-223.

[3] Zou Z,Anisowicz A,Hendrix MJ,et al.Maspin,a serpin with tumor-suppressing activity in human mammary epithelial cells〔J〕.Science,1994,263(5146):526-529.

[4] Maass N,Teffner M,Rosel F,et al.Decline in the expression of the serine proteinase inhibitor maspin is associated with tumour progression in ductal carcinomas of the breast〔J〕.J Pathol,2001,195(3):321-326.

[5] 邹纪东，徐 伟，吕正华，等.下咽癌中maspin表达与血管和淋巴管生成的相关性〔J〕.山东大学学报 (医学版)，2010，48(12)：82-85.

[6] Joukov V,Pajusola K,Kaipainen A,et al.A novel vascular endothelial growth factor,VEGF-C,is a ligand for the Flt4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases〔J〕.EMBO J，1996,15(2):290-298.

[7] Maeda K,Yashiim M,Nishihara T.Correlation between Va-scular endothelial growth factor-C expression and lymph node metastasis in T1 carcinom of the colon and rectum〔J〕.Surg Today,2003,33:736-739.

[8] 帖晓静，史成章，王丽玲，等.血管内皮生长因子-C与CCR7在大肠癌中的表达〔J〕.实用癌症杂志，2008，23(1)：44-46.

[9] Zhang HH,Qi F,Zu XB,et al.A proteomic study of potential VEGF-C-associated proteins in bladder cancer T24 cells〔J〕.Med Sci Monit，2012,18(11):BR441-9.

[10] 白玉贤，易继林，刘胜霞.Maspin蛋白与血管内皮生长因子-C在胃癌组织中的表达及其意义〔J〕.实用肿瘤学杂志，2007，21(6)：522-524.