CXCL12-CXCR4在胃癌中的表达及其与腹腔转移的意义

峗淑莉 冯起校 刘振海

在胃癌中，腹腔内转移是比较常见的事件，也是晚期胃癌患者死亡的常见原因之一，胃癌患者合并腹腔内转移，5年生存率只有2%，且对各种治疗包括全身化疗、腹腔内化疗效果很差。近年来的研究表明，趋化因子与其受体结合后通过激活一系列细胞内信号转导通路及效应分子参与多种肿瘤的转移过程。目前对于趋化因子及其受体研究较多的是CXCL12-CXCR4轴。本研究拟通过免疫组化的方法和Transwell小室迁移实验观察CXCR4的表达与胃癌腹腔转移的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

自2009年4月至2013年3月从本院外科手术切除的胃癌病例中选取63例免疫组化的胃癌组织标本，其中腹腔转移(包括淋巴结转移、腹膜转移)29例，无腹腔转移34例。所有病例均由组织病理学检查证实，术前均未接受放化疗。Transwell小室迁移实验中研究对象是胃癌SGC7901细胞。

1.2 材料与试剂

鼠抗人CXCR4单克隆抗体购自Santan Cruz公司，免疫组织化学SP试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。Transwell小室模型购自Corning公司。

1.3 免疫组化方法

①胃癌组织标本给予10%甲醛处理，并常规石蜡包埋后制备4 μm厚连续切片。②切片脱脂后，经0.3%过氧化氢-甲醇溶液浸泡30 min，以使内源性过氧化物酶失活。③将切片放入盛有0.01 mol/L 柠檬酸缓冲液(pH 6.0)的高压灭菌器内加热到120 ℃ 5 min。④室温下将切片放入1%白蛋白的磷酸缓冲液(PBS)中孵育30 min，以减少非特异性着色。⑤在室温下滴加CXCR4一抗孵育1 h。⑥室温中将处理过的切片放入二抗标记的过氧化物酶液中孵育15 min。⑦切片经苏木精着色。PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 免疫组化结果判定

阳性判定标准：根据Mattern等[1]的阳性表达判断的计数方法，CXCR4阳性细胞着色定位于细胞质或细胞膜，采用盲法对所有切片进行计数。阳性细胞指的是染色后呈现棕黄色的细胞，或者是棕褐色的细胞。每张切片于肿瘤区域随机取高倍视野100个(×400)，从每个视野中读取200个细胞计数阳性细胞数，算出每个视野的阳性率，对所有视野的阳性率计算平均值。

统计指标：参照Iwasa等[2]研究中胃癌细胞中染色强度标准，采用视觉评分等级，将CXCR4的表达划分为4个等级。无CXCR4免疫染色的为等级0；CXCR4免疫染色数<10%的为等级1+；CXCR4免疫染色数≥10%～50%的为等级2+；CXCR4免疫染色数>50%的为等级3+。

1.5 Transwell小室迁移实验方法

接种5×104/100 μl的胃癌SGC7901细胞至Transwell小室的上室，实验组在下室加27 μl含CXCL12趋化因子(1640培养基加0.5%BSA加100 ng/ml CXCL12)的液体诱导其迁移。对照组下室只加1640培养基(含0.5%BSA)，置于饱和湿度是37 ℃、5%CO2下培养15 h，随后取出小室，将上层细胞用棉签擦去，常温下在4%多聚甲醛中固定15 min。在PBS洗2次后风干，再用0.1%结晶紫染色15 min，用纯水洗3次，风干。置于显微镜下观察，各取5个200×视野，计算穿膜细胞的数量，并且算出每个视野中平均穿膜细胞数。

1.6 统计学分析

所有的数据统计分析应用SPSS13.0统计软件包(SPSS，Chicago，IL)进行分析，计量资料均以均数±标准差表示，计数资料以百分比表示，免疫组化CXCR4表达阳性率的比较采用χ2检验，Transwell小室迁移实验的比较采用t检验。相关性采用多元素分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXCR4在有无腹腔转移的胃癌组织中的表达情况

免疫组化显示CXCR4在胃癌细胞的胞膜或胞质中表达，在有腹腔转移(淋巴结转移19例，腹膜转移10例)的胃癌中，CXCR4的阳性表达率为72.41% (21/29)，在无腹腔转移的胃癌组织中，CXCR4的阳性表达率为38.23%(13/34)，两者比较差异有统计学意义(χ2=7.359，P<0.05)。

2.2 CXCR4的表达与胃癌临床病理的关系

CXCR4的表达与胃癌患者的性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、浸润深度均无关，而与腹腔转移的有无有显著关系，见表1。

表1 CXCR4与胃癌临床病理参数的关系(例，%)

2.3 CXCL12-CXCR4轴对胃癌细胞迁移的影响

通过Transwell小室迁移实验发现，在Transwell小室下室中加入趋化因子CXCL12，能促进胃癌细胞SGC7901的迁移。实验组的穿膜细胞数为(52.80±6.69)个细胞，对照组为(27.80±8.23)个细胞，P=0.001，2组间差异有统计学意义，提示CXCL12-CXCR4轴对胃癌细胞迁移有重要的作用。

3 讨论

本研究采用免疫组化的方法探讨了CXCR4在有腹腔转移及无腹腔转移的胃癌手术切除标本中的表达情况，并通过Transwell小室迁移实验验证CXCL12-CXCR4轴对胃癌细胞迁移的影响。研究结果表明CXCR4的阳性表达与胃癌的腹腔转移是有密切关系的，CXCL12-CXCR4轴可作为评估胃癌腹腔转移的1个观测指标。

趋化因子不仅对淋巴细胞归巢和免疫功能的保持起到非常重要的作用，而且也影响到血管再生、胶原蛋白的合成、骨髓细胞的生成。已有研究证明，趋化因子系统是上皮肿瘤细胞的产生机制之一，能够调节白细胞转移和归巢。肿瘤细胞的趋化因子受体表达在肿瘤生物学中起到至关重要的作用，尤其是，CXCR4的表达与不同肿瘤细胞在体内外的表现之间的关系更为密切[3]。在正常组织中CXCR4广泛表达，对胎儿生长、造血干细胞的运作以及淋巴细胞转移起着基础性的作用[4]。

CXCL12-CXCR4轴在胃癌的演进过程中起着重要的调控作用。Ishigami等[5]通过免疫组化的方法发现，在185例胃癌患者的胃癌组织学标本中，有74例CXCL12阳性表达，且其阳性表达与胃癌淋巴结转移、浸润深度、淋巴管浸润、肿瘤最大直径及临床分期有关。Lee等[6]对5种胃癌细胞系采用反转录酶-聚合酶链锁反应( RT-PCR)、蛋白质印迹、流式细胞术和共聚焦显微镜方法研究CXCR4的表达情况，探讨221例胃癌患者中CXCR4表达和临床特征之间的关系。结果表明，CXCR4表达与淋巴结转移显著相关，并且与存活率的减少也相关，CXCR4的表达与胃癌细胞体内移行有关，在胃癌恶化中起到重要的作用。徐斌等[7]采用S-P 免疫组化法及RT-PCR探讨胃癌组织中CXCR4 和MMP-9 的表达情况，结果发现，胃癌CXCR4和MMP-9 的表达之间存在一定相关性，两者的表达与胃癌淋巴结转移呈正相关。本研究也证实了胃癌腹腔转移与CXCL12的受体CXCR4在胃癌中的表达相关，与肿瘤大小、浸润深度无关，可能与本研究标本例数较少有关。Yasumoto等[8]认为趋化因子与胃癌腹膜种植转移的发展有关系，在检验临床患者中发现，来自有腹膜癌病者的恶性腹腔积液中含有高浓度的CXCL12 (4.67 ng/mL)，免疫组织化学分析表明，2/3的有腹膜转移的胃癌中CXCR4表达，然而有1/4的远处转移胃癌的CXCR4的表达阳性。CXCR4表达的原发肿瘤中85%会发展成腹膜转移。原发性胃癌的CXCR4表达与腹膜种植转移的发展显著相关。CXCR4/CXC12轴在胃癌的腹膜种植转移的发展中起重要的作用。这与本研究结果相一致。他们的动物实验发现在裸鼠体内注入人的胃癌细胞系会形成大量的恶性腹腔积液，并有选择地表达CXCR4 mRNA，尤其是，NUGC4细胞表达出高浓度的CXCR4 mRNA，快速增强了蛋白激酶B/Akt的磷酸化作用，在裸鼠体内AMD3100(一种特殊的CXCR4拮抗剂)能够有效地减缓肿瘤生长和恶性腹腔积液的形成。

本研究也用Transwell小室模型体外证实了CXCL12-CXCR4轴能促进胃癌细胞SGC7901的迁移。关于CXCL12-CXCR4轴影响胃癌腹腔内转移的机制，目前只有少数的报道，Hashimoto等[9]发现CXCL12促进胃癌的腹腔内播散是通过激活mTOR通路，升高基质金属蛋白酶的表达，增强转移能力。CXCL12-CXCR4轴影响胃癌腹腔内转移的机制的深入研究，将为治疗胃癌合并腹腔内转移提供新的治疗靶点，并为进一步治疗和预防胃癌的淋巴结转移提供实验数据和理论基础。

[1] Mattern J，Koomagi R，Volm M.Associalion of vascular endothelial growth factor expression with intratumoral microvessel densilv and tumour cell proliferation in human epidermoid lung carcinoma〔J〕.Br J Cancer，1996，73(7)：931-934.

[2] Iwasa S，Yanagawa T，Fan J，et al.Expression of CXCR4 and its ligand SDF-1 in intestinal-type gastric cancer is associated with lymph node and liver metastasis〔J〕.Anticancer Res，2009，29(11)：4751-4758.

[3] Kucia M，Jankowski K，Reca R，et al.CXCR4-SDF-1 signalling，locomotion，chemotaxis and adhesion〔J〕.J Mol Histol，2004，35(3)：233-245.

[4] Rossi D，Zlotnik A.The biology of chemokines and their receptors〔J〕.Annu Rev Immunol，2000，18：217-242.

[5] Ishigami S，Natsugoe S，Okumura H，et al.Clinical Implication of CXCL12 Expression in Gastric Cancer〔J〕.Ann Surg Oncol，2007，14(11)：3154-3158.

[6] Lee HJ，Kim SW，Kim HY，et al.Clinical implication of CXCL12 expression in gastric cancer〔J〕.Int J Oncol，2009，34(2)：473-480.

[7] 徐 斌，韩绍伟，周笑珍，等.CXCR4 和 MMP-9 在胃癌组织中表达及其与淋巴结转移的关系〔J〕.医学研究杂志，2012，41(4)：112-115.

[8] Yasumoto K，Koizumi K，Kawashima A，et al.Role of the C-XCL12/CXCR4 axis in peritoneal carcinomatosis of gastric cancer〔J〕.Cancer Res，2006，66(4)：2181-2187.

[9] Hashimoto I，Koizumi K，Tatematsu M，et al.Blocking on the CXCR4/mTOR signalling pathway induces the anti-metastatic properties and autophagic cell death in peritoneal disseminated gastric cancer cells〔J〕.Eur J Cancer，2008，44(7)：1022-1029.