重组人血管内皮抑素对肺腺癌放射增敏作用的动物实验研究

张蓓蓓 高春玲 程小峰 王笑良 陈玉强 吴晓安 章志勇

肺癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，而且其发病率逐年上升，其中非小细胞肺癌的发生率占肺部肿瘤的80%以上[1]。在临床上肺癌的治疗主要依赖手术、放疗、化疗和分子靶向治疗四大手段，早期以手术为主，中晚期通常采用综合治疗的手段，我国70%左右的患者在确诊时已处于晚期[2]，无法进行手术治疗，主要采用放化疗结合的综合治疗。而放疗在治疗局部中晚期非小细胞肺癌中起到重要作用，所以提高肿瘤细胞对放射治疗的敏感性，必将提高非小细胞肺癌的治愈率。近年来，有研究发现重组人血管内皮抑素能够增强放射线对肿瘤的杀灭效应[3]。本文主要探讨重组人血管内皮抑素联合放疗对肺腺癌的作用。

1 材料与方法

1.1 动物及细胞系

本实验动物为裸鼠，裸鼠的喂养和使用都根据厦门大学的指南和规范。细胞的培养应用加入10%的胎牛血清的DMEM培养基。细胞每周常规传代2次。置于5% CO2和 37°C饱和湿度培养箱中培养。细胞系为人肺腺癌细胞系973。

1.2 药物及给药方法

重组人血管内皮抑素为无色透明液体，规格5 mg/ml，用药浓度为2 mg/kg，采用生理盐水稀释。根据实验分组方法和每只裸鼠的体重计算给药的剂量，然后腹腔注射已经稀释好的药液，对照组注射同等体积的生理盐水。肿瘤最大径增长至0.5 cm时开始用药，每天1次，连续用药14天。

1.3 肿瘤模型的建立和分组

将973细胞置于DMEM完全培养基中培养，细胞呈指数分裂状态时，消化后制成107/L细胞密度的悬液。每只鼠右下肢大腿皮下注入0.3 ml细胞悬液形成肿瘤模型。荷瘤鼠随机分成4组：空白对照组，单照组，联合治疗组，单药组，每组各8只裸鼠。

1.4 照射方法及照射条件

用6MV直线加速器(瓦里安公司，美国)放疗。将荷瘤裸鼠装入一自制的有机玻璃盒内，并将其用橡皮圈固定在一塑料板上。肿瘤暴露在正中，裸鼠其他部分采用铅块遮挡，肿瘤表面加盖1.5 cm有机玻璃板作为组织补偿，于重组人血管内皮抑素用药第1天进行单次照射，照射剂量为15 Gy。

1.5 评价方法

分组后，观察荷瘤裸鼠的一般情况，实验中采用盲法每2日由专人用游标卡尺测量移植瘤的最长径(A)、垂直径(B)以及瘤的高度(C)，并按公式V=π/6·A·B·C计算肿瘤体积。当各组肿瘤的体积增长至用药时的肿瘤体积两倍时为实验终止点。 肿瘤生长延缓时间：绝对肿瘤生长延缓时间(AGD，absolute growth delay)=TR-TC(TR 为单纯照射组小鼠肿瘤体积增长2倍的天数，TC为对照组小鼠肿瘤体积增长2倍的天数)。规格化肿瘤生长延缓时间(NGD，normalized growth delay)=TL-TG(TL为联合治疗组小鼠肿瘤体积增长2倍的天数，TG为单纯药物组小鼠肿瘤体积增长2倍的天数)；增敏系数(EF)=NGD/AGD。 EF>1 提示有放射增敏效应。

1.6 评价指标

如果增敏系数EF>1，提示有放射增敏效应。

1.7 统计学分析

采用origin软件绘制肿瘤生长曲线，应用SPSS软件进行统计学分析，统计方法采用Mann-Whitney u检验。P<0.05 为差异有统计学意义；P<0.01为差异高度统计学意义。

2 结果

2.1 荷瘤鼠的一般情况

分组后，观察荷瘤裸鼠的一般情况：空白对照组进食及活动状况良好，6只右下肢荷瘤部位皮肤溃烂；单药组进食及活动状况良好，2只肿瘤表面皮肤溃烂；单照组和联合治疗组荷瘤裸鼠的进食略减少，2只肿瘤表面皮肤溃烂。

2.2 肿瘤生长曲线

根据各组小鼠肿瘤的体积绘制肿瘤生长曲线。空白对照组、单药组肿瘤生长情况相似；15 Gy单照组从第8天开始，肿瘤生长较空白组受到不同程度抑制(P<0.01)，联合治疗组肿瘤生长较空白组生长抑制明显(P<0.01)，各组肿瘤生长曲线见图1。

图1 各组荷瘤裸鼠的肿瘤生长抑制曲线

2.3 肿瘤生长延迟和增敏系数

空白对照组肿瘤体积增长至2倍时的天数为5天，单药组肿瘤体积增长至用药时的肿瘤体积2倍时的天数为12天，单照组肿瘤体积增长至放射前2倍时的天数为12天，联合治疗组肿瘤体积增长至用药时肿瘤体积2倍时的天数为25天。增敏系数为1.9。肿瘤体积2倍倍增时间和肿瘤生长延迟时间应用Origin软件计算，见表1。

表1 各组肿瘤生长延缓时间及重组人血管内皮抑素的增敏系数

3 讨论

放射治疗是治疗肿瘤的1种重要手段，在恶性肿瘤患者的治疗中50%以上接受放射治疗[4]，但是，单独接受放射治疗治愈率往往不高，因为肿瘤的发生、发展是多种因素、多种途径以及多种基因变化共同作用的过程，需要放射联合具有协同或增敏作用的其他药物从多个角度来杀伤肿瘤细胞。血管的生成在肿瘤的发生、发展过程中起到举足轻重的作用，因此抗肿瘤血管生成的治疗方法就成为了目前研究的热点。

重组人血管内皮抑素是1种血管生成抑制剂，是由O'Reilly等[5]首次从鼠血管内皮瘤的细胞系培养基中提取出来的。它能够通过抑制内皮细胞的增殖、诱导内皮细胞的凋亡、抑制血管内皮生长因子、抑制内皮细胞的迁移从而抑制肿瘤血管的生成[6]，进而抑制肿瘤的生长、侵袭以及转移来发挥抗肿瘤作用。此外，重组人血管内皮抑素可以使肿瘤血管出现短暂的“正常化”[7-8]，在这个短暂的时间窗内肿瘤可以重新获得正常的氧供，从而提高了放射线的杀伤效率。重组人血管内皮抑素还具有副作用小[9]、不易产生耐药性及不易复发等优点[10]。

在本实验中，以人肺腺癌973细胞系为研究对象，建立移植瘤模型，通过不同的处理方式作用于荷瘤裸鼠，观察重组人血管内皮抑素的作用效果。从肿瘤的生长曲线来看，相较于空白对照组，单药组、单纯放疗组、联合治疗组肿瘤的生长都不同程度的受到抑制，但是联合治疗组抑瘤效果较其他组更加明显。通过计算各实验组的倍增时间，发现联合治疗组肿瘤体积增长至用药时的肿瘤体积2倍时的天数为25天，明显长于其他实验组。计算增敏系数EF为1.9>1，我们就可以认为，重组人血管内皮抑素对放疗有轻微的增敏效应。我们的实验研究结果提示，重组人血管内皮抑素能够显著抑制肿瘤的生长，可能对肺腺癌的放射治疗具有增敏效应，对提高肺腺癌的放疗效果具有良好的应用前景。

但是，肿瘤的发生发展是一个复杂的过程，在我们的实验中重组人血管内皮抑素具有轻微的放射增敏效应，分析原因可能为照射时间为用药第1天，肿瘤内血管尚未处于血管正常化的时间窗。我们将就此方面做进一步研究。另外，重组人血管内皮抑素确切作用机制及放射增敏作用机制尚未明确阐述，我们也将就重组人血管内皮抑素放射增敏作用机制进行深入研究。

[1] Pignon J Tribodet H，Scaglioti GV，et al.Lung adjuvant cisplatin evaluation：a pooled analysis by the LACE Collaborative Group〔J〕.J Clin Oncol，2008，26(21)：3552-3559.

[2] Azim HA Jr，Elatar I，Loberiza FR Jr，et al.Third generation triplet cytotoxic chemotherapy in advanced non-small cell lung cancer：a systematic overview〔J〕.Lung Cancer，2009，64(2)：194-198.

[3] Ziche M，Donnini S，Morbidelli L.Development of new dru-gs in angingenesis〔J〕.Curr Drug Targets，2004，5(5)：485-493.

[4] Ringborg U，Bergqvist D，Brorsson B，et al．The Swedish C-ouncil on Technology Assessment in Health Care(SBU)systematic overview of radiotherapy for cancer including a prospective survey of radiotherapy practice in Sweden 2001一summary and conclusions〔J〕．Acta Oncol,2003，42(5-6)：357-365.

[5] O'Reilly MS，Boehm T，Shing Y，et al.Endostatin：an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth〔J〕.Cell，1997，88(2)：277-285.

[6] Dong GY，YE B，YU XH，et al.Clinical observation of recombinant human endostatin combined stereotactic radiotherapy in advanced malignant tumors〔J〕.Chin Clin Oncol，2009，14(11)：1035-1037.

[7] Fukumura D，Jain RK.Tumor microvasculature and microenvironment：targets for anti-angiogenesis and normalization〔J〕.Microvasc Res，2007，74(2-3)：72-84.

[8] Huang G，Chen L B.Recombinant human endostatin improves antitumor efficacy of paclitaxel by normalizing tumor vasculature in Lewis lung carcinoma〔J〕.J Cancer Ras Clin Oncol，2010，136(8)：1201-1211.

[9] 章 骏，赵 怡，杨志刚，等.恩度联合化疗治疗多种恶性复发肿瘤转移灶的疗效观察〔J〕.实用癌症杂志，2011，26(1)：69-70.

[10] Feldman AL，Restifo NP，Alexabder HR，et a1.Antiangiogenic gene therapy of cancer utilizing a recombinant adenovirus to elevate systemic endostatin levels in mice〔J〕.Cancer Res，2000，60(6)：1503-1506.