环境雌激素双酚A对花背蟾蜍血清蛋白的影响

王江博，李延清，慧 恒，孙志宏

(延安大学生命科学学院，陕西 延安 716000)

近年来，环境雌性激素效应日益引起学术界的关注，大量调查资料表明环境中能模拟雌激素作用的化学物质较多，人们将这一大类具有雌激素样作用的化学物称为环境激素(environmental esrogens,EEs)。它们能影响生物机体的分泌、转动、结合、排泄、生理作用等，从而影响生死系统发育，破坏内分泌系统平衡，从而导致肿瘤。环境雌激素是人类及动物的重要研究方向之一[1]。

目前，属于环境雌激素的化学物质较多，双酚A(bisphenol A,BPA)就是其中的一种，它是酚类化合物中具有代表性的环境污染物。BPA化学名称为二酚基丙烷，分子式C15H16O2，水中溶解度为1000 mg/L，毒性偏低，易溶于醇、醚、丙酮、脂类等有机溶剂[2]。BPA被广泛地用于生产各种碳酸聚酯类塑料，如碳酸聚脂、环氧树脂及杀菌剂等，并不断开发新用途。随着塑料制品及环氧树脂的广泛应用，BPA的污染物在环境中的排放量逐渐增加，它们在环境中降解释放出BPA，造成严重的环境污染，从而对人类和动物造成一定的影响。由于BPA的效应已经引起人们的关注，所以对BPA的研究已有了初步的进展，主要体现在，(1)生殖毒性，BPA具有内分泌干扰物作用，对雄性生殖系统有一定的损害；(2)胚胎发育毒性和致畸性；(3)致癌作用[3]。目前BPA对人和小鼠影响的研究较多，但对具有独特生活习惯两栖类动物研究较少，所以我们通过对花背蟾蜍腹腔注射不同浓度的BPA对其血清蛋白所产生的影响进行初步探索。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

游标卡尺，中国上海；电子天秤 MP200A，上海精科天平；离心机 KDC-40，科大创新股份有限公司中佳分公司；电泳仪 DYY-Ⅲ1型稳压，北京六一仪器厂；电泳槽 DYYⅢ型，北京六一仪器厂；乙酸纤维素薄膜 规格28 cm，路桥四甲生化塑料厂；紫外可见分光光度计 752 N：上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验试剂药品

花生油：鲁花压榨一级花生油山东鲁花集团有限公司；BPA：国药集团化学试剂有限公司；巴比妥：西安化学试剂厂；巴比妥钠：西安化学试剂厂；氨基黑10B：中国上海标本模型厂；甲醇：西安化学试剂厂；乙醇：西安化学试剂厂；冰醋酸：天津市百世化工有限公司；柠檬酸三钠：西安化学试剂厂；氢氧化钠：天津市致远化学试剂有限公司。

巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6离子强度0.07)配制方法[3]：巴比妥2.76 g；巴比妥钠15.45 g，加水至1000 ml；染色液：氨基黑10B0.25 g，甲醇50 ml，冰醋酸10 ml，蒸馏水40 ml；漂洗液 甲醇或乙醇45 ml，冰醋酸5 ml，蒸馏水50 ml，透明液 无水乙醇75 ml，冰醋酸25 ml，血液抗凝剂3.8 g柠檬醋三钠，加蒸馏水至100 ml，BPA溶液：取BPA溶解于花生油分别配成浓度为50 μmol/kg，100 μmol/kg，150 μmol/kg 的BPA溶液NaOH溶液：0.4 mol/l。

1.3 实验动物

取16只花背蟾蜍，体重85±5 g，分成四组，对照组(注射花生油)，低剂量组(50 μmol/l)，中剂量组(100 μmol/l)，高剂量组(150 μmol/l)，注射不同剂量的BPA溶液1 ml，注射6 d，第7 d集中解剖。

1.4 取样

固定花背蟾蜍，剪开胸腔，心脏取血(每只蟾蜍约可抽取1 ml鲜血)，以4∶1加入柠檬酸三钠溶注入离心管内，立即离心，(3000 R/min，3 min)离心后，取血清备用。

1.5 实验方法

参照醋酸纤维薄膜电泳法[4]。用氨基黑10B染色液染色10 min，然后用漂洗液漂洗3次，每次5 min，即可在薄膜上出现清晰的谱带.选取谱带多而清晰的薄膜量取膜上各条带的泳动距离，然后放在清水中进行照相。拍照后，对入选膜进行定量测定，即将薄膜上的各个蛋白带剪下，分别放入9支试管中，同时在相应膜上剪下大小相同的无蛋白区的薄膜放入第10支试管中作为空白对照。然后向各管加入NaOH溶液(0.4 mol/L) 4 mL，在37℃条件下水浴30 min后浸泡12 h，在722型分光光度计620 nm处比色，记录A620 nm值。根据各蛋白区带的A620值计算其相对含量。各种蛋白质的相对含量等于其A620 nm值占蟾蜍血清蛋白A620 nm总值的百分比。泳动度按U=dL/Vt公式计算，式中d为电泳图谱中各条带的泳动距离，L为支持物的有效长度，V为110 V，t为7200 s[5]。

2 结果

2.1 蟾蜍的形态学的观察

饲养花背蟾蜍的过程中，注射花生油对照组的生长情况良好，给实验组注射不同剂量的BPA，出现行动迟缓，精神低靡，随着BPA剂量的增大，这种情况越来越明显，与对照组形成明显对比。在解剖花背蟾蜍过程中，发现花背蟾蜍体内有少量油花，实验组的中、高剂量组体内有腹水。实验组随着BPA剂量的增加，对中、高剂量组心脏上造成不同程度的损伤，心包膜上小点越来越明显，粘稠性增加，心跳加快，但搏动无力。

2.2 花背蟾蜍血清电泳图谱

结果表明，花背蟾蜍的血清蛋白经过醋酸纤维薄膜电泳，发现对照组，实验组中的低剂量组可分离出9条蛋白条带，也就是说明该血清中有9种蛋白质，这9种蛋白质的分类及编号参照蟾蜍血清中各种蛋白质泳动度的名称编号[6]。对照组，实验组中的低剂量组中，清蛋白区有4种，球蛋白区有5种，两区之间有明显的蛋白空白区，这9种蛋白从正极开始依次为：α1-清蛋白、α2清蛋白、β1-清蛋白、β2-清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白、δ-球蛋白、ε-球蛋白[7]。实验组中：中、高剂量组电泳条带中有8条蛋白条带，缺少γ-球蛋白条带。测对照组和实验组中的低、中、高剂量组蟾蜍各血清蛋白质的OD值时，发现各蛋白的含量有显著的差异(图1)。对照组和低、中、高剂量组的酸纤维薄膜电泳图谱(表1)，花背蟾蜍血清中各种蛋白的迁移率见表2，各种蛋白质含量的差异显著(表3)。

图1 蟾蜍血清电泳条带中蛋白质含量的测定

表1 蟾蜍血清的电泳图谱

表2 花背蟾蜍血清中的部分蛋白的迁移率

表3 花背蟾蜍血清中各种蛋白质的含量

注释：这是在紫外可见分光光度计752 N在D620 nm处的OD值。

3 讨论

BPA是一种环境雌激素，也是一种低毒性物质，能影响生物机体的分泌、转动、结合、排泄、生理作用等，破坏内分泌系统平衡，从而影响生物的生存、发育[8]。对照组中：注射花生油，花生油是一种脂肪，部分花生油能被蟾蜍脏器吸收，为花背蟾蜍提供物质能量来源，所以对照组的花背蟾蜍生长状态良好。实验组中：注射了BPA，对花背蟾蜍机体造成一定的影响，如肝、心脏、肺、肾等有显著影响，这就使实验组的花背蟾蜍机体的分泌、转动、结合、排泄、生理作用等产生了一定影响，这种影响随着注射BPA剂量的增大而越明显，心脏搏动加快、行动迟缓、精神低靡。

动物血清中含有多种蛋白质，不同种类的蛋白质，有其独特的一级结构和构象，在pH值相同的同一种缓冲溶液的电场中，它们的带电性质和带电量不同，各种蛋白质的构象不同，等电点也有所不同(一般小于7.0)，通过电泳将血清中不同种类的蛋白分离[9]。如果动物血清中的蛋白受到一定的影响，如构象、带电性质、带电量、等电点发生了改变，也就是蛋白发生了一定程度的变性，失去生物活性，这样电泳技术就很难把变性的血清蛋白分离出来[10]。

实验的对照组中，没有注射BPA，血清蛋白没有受到影响，所以能把血清中的9种蛋白分离出来。在实验中的低剂量组中，由于BPA注射剂量较小，对蟾蜍血清蛋白的影响不明显。而在中、高剂量组中，γ-球蛋白没有被分离出来，与对照组相比少了一条蛋白条带，这可能与BPA在机体中的运输方式有关[11]。BPA是一种环境雌激素， 在进入机体后与细胞内雌激素受体结合，通过多种机制产生拟雌激素或抗雌激素作用，从而干扰内分泌系统的正常功能[12-13]。据实验结果推测：γ-球蛋白可能是BPA在花背蟾蜍体内的受体。BPA对这个受体—γ-球蛋白有毒性作用，且随注射剂量的增大，影响越明显。使γ-球蛋白变性，失去生物活性，导致电泳技术无法分离出来[14]。

蟾蜍血清的电泳时间，电流强度，电压大小，点样笔等，在众多资料中还有很大的差异，但是点样还是电泳技术的关键[15]。

参考文献：

[1] 王佳,詹平.双酚A对机体影响及其机制的研究进展[J].预防医学情报志,2005,21(5): 541-543.

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[7]刘建强,孟青妹.青海蟾蜍血清蛋白质成分的电泳分析[J].中国兽医科技,2003,33(10): 64-65.

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[10]林勇,张浩,王文东,等.围生期BPA暴露对雄性子代大鼠中脑巴胺神经细胞亡的影响[J].四川大学学报(医学版),2006,37(4): 570-573.

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