丁苯酞对血管性痴呆大鼠脑组织BDNF表达的影响

赵 俊 李 昕 孙玉华

(河南大学淮河医院神经内科，河南 开封 475000)

近年来，随着我国老龄化趋势的加重，老年痴呆的患者数量呈逐年增加的趋势。而血管性痴呆(VD)主要由脑血管性病变引起，导致患者认知、学习和记忆障碍。研究表明，早期干预及合理治疗，能够延缓病情的发展。本实验旨在观察丁苯酞作用于VD大鼠后脑内源性神经营养因子(BDNF)变化的影响, 探讨丁苯酞对 VD 的作用机制。

1 材料和方法

1.1实验动物及主要试剂 14～15月龄的健康 SD 大鼠 60 只, 体重550～650 g。由河南省郑州大学实验动物中心提供。丁苯酞:批号: 050106;兔抗鼠BDNF多克隆抗体、SP 免疫组化试剂盒、BDNF ELISA 检测试剂盒购自博士德公司，NAB 显色试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。

1.2动物模型、动物分组与给药

1.2.1动物模型的建立: 根据 Olsso n 方法〔1〕结扎双侧颈总动脉。假手术组分离但不结扎颈总动脉。

1.2.2动物分组与给药方法 将造模成功的 VD 大鼠随机分为模型组(MDG)、丁苯酞组(DBT)、假手术组(SOG)，每组20只。DBT组造模后第 61天开始治疗,每灌服丁苯酞 12 mg/100 g; MDG 和 SOG 以等量消毒花生油灌胃;各组均给药1次/d, 连续给药 30 d。

1.3痴呆标准 以SOG组大鼠逃避潜伏期的平均值作为参考,计算结扎大鼠逃避潜伏期的平均值与参考值之差占该鼠逃避潜伏期的比值,若该值>20%为痴呆鼠。

1.4认知功能测试及病理学检测

1.4.1大鼠认知能力测试 采用 Y型电迷宫法于模型制作 60 d后再三等分 Y型电迷宫内进行大鼠学习能力测试。先将大鼠放入迷宫内适应 5 min, 使其对三臂均探索进入,然后从起步区臂出发, 开始以随机次序变换测试。设定电压 40 V,延迟时间 5 s。电击后大鼠直接逃避至安全区为正确反应, 否则为错误反应。每测1次休息 30 s ,测 10次休息 5 min。大鼠学习成绩以连续 10次测试中有 9次 (9/10)正确反应时所需的电击次数(尝试次数)表示。每次测试均在安静和光线稍暗的条件下进行。6 h后进行记忆能力测试, 对于上述达到 9 /10标准的大鼠再次测试 10次,记录其中正确反应的次数。

1.4.2电镜标本的制备 大鼠断头处死后, 参照大鼠脑图谱,迅速切取右侧海马区组织块, 迅速放入预冷 4e 的 4% 的戊二醛中固定,常规脱水、 Epo n812 环氧树脂包埋, LKB超薄切片,醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色,日立 H- 7500 型透射电镜观察。

1.4.3免疫组化染色 采用SP法及定量分析计数方法。在海马CA1区,分别选择 3 个相邻视野, 在 400 倍光镜下随机查 100 个神经元计数阳性细胞数,结果取 3 个视野的平均值。

1.5BDNF 含量测定 90 d后快速处死动物后,取左侧大脑半球,匀浆, 离心后取上清,采用 BDNF 的 ELISA 试剂盒,按说明书逐步操作,最后在酶标仪 450 nm 处读出 A 值, 依照标准含量与 A值建立一元回归方程以及标准曲线, 取在标准曲线范围内的测量值作方差分析。

2 结 果

2.1病理学电镜结果 SOG组未见明显病理变化;MDG可见神经细胞高度水肿,皮质下和海马区有结构较松散的软化灶,胞体缩小,胞核固缩,胞浆致密,海马CA1区细胞数减少, 胞间距离增大; DBT组皮质偶见小的软化灶,细胞数和形态接近正常对照组。见图1。

2.2各组大鼠学习记忆能力测试 见表1。

2.3各组海马内BDNF免疫反应阳性细胞数 MDG组、DBT组免疫反应阳性细胞数(77.875±2.031，92.750±4.713)显著高于SOG组(64.250±3.772)(P<0.05)。

2.4各组动物大脑内 BDNF的含量 MDG组、DBT组大鼠脑中BDNF含量〔(28.69±2.484)ng/g,(37.174±3.878)ng/g〕显著高于SOG组〔(18.875±3.903)ng/g〕(P<0.05)。

MDG组

DBT组

SOG组

组别尝试次数10次正确数SOG组44.1 ± 2.28.75 ± 1.06MDG组79.9 ± 2.11)5.12 ± 1.131)DBT组55.7 ± 2.61)2)7.51 ± 1.071)2)

3 讨 论

随着我国老龄化趋势的加重，VD的发病率也逐年提高；缺血性损害已成为公认的造成VD的主要病因。丁苯酞作为一种线粒体保护剂，其左旋体存在于芹菜籽中〔2〕。其主要作用是维护线粒体的结构和功能,从而达到改善缺血区微循环的目的〔3，4〕。有动物实验表明〔5〕,在缺血性脑卒中治疗中丁苯酞具有很好的作用。近年来，一类种类较多的特殊蛋白质分子——神经营养因子，引起了学者的关注。而BDNF作为其中的一种，对脑缺血有保护作用。本实验结果发现丁苯酞能够明显提高缺血后大鼠的记忆和学习能力,并逐步改善认知功能。作为大脑边缘系统重要组成部分的海马在学习和记忆等一系列高级神经活动中起着关键的作用,因此海马结构的损害可能是引发VD的重点之一。本实验也表明丁苯酞确实能减少海马神经元在缺血状态下的坏死程度,从而减轻脑组织不可逆的损害,与近年来国内外专家的研究结果相一致〔6〕。

神经营养因子是一类特异性的蛋白质。BDNF是重要的神经营养因子家族成员，随着进一步的研究, 人们发现BDNF具有明确的促进神经细胞生长、分化和存活作用;有研究表明〔7〕，外源性BDNF的注入，可造成脑梗死体积缩小,同侧大脑新皮质神经元细胞核中广泛分布BDNF样免疫反应产物,说明BDNF可以对抗缺血性脑病。

综上，丁苯酞通过内源性BDNF的表达实现对神经元的保护作用, 但是关于丁苯酞如何启动了内源性BDNF表达，机制尚不十分清楚，有待今后进一步研究阐明。

4 参考文献

1Olsson Y, Brun A, Engiuund E.Fundamental pathological in vascular dementia 〔 J 〕1 Acta Neurol Suppl, 1996；168(1):31-8.

2崔丽英, 李舜伟, 吕传真,等.恩必普软胶囊治疗中度急性缺血性卒中的多中心开放临床研究〔J〕.中国脑血管病杂志,2005;2(3):112 -5.

3熊 杰,冯亦璞.丁基苯酞对局灶性脑缺血过程中线粒体损伤的保护作用 〔J〕.药学学报,2000;35(6):408-12.

4董高翔, 冯亦璞.丁基苯酞对局部脑缺血再灌注大鼠脑线粒体ATPase抗氧化酶活性和脂质过氧化的影响〔J〕.中国医学科学院学报,2002;24(1):93-7.

5Fiorella D, Heiserman J,Prenger E,etal.Assessment of the reprodu cibility of postprocessing dynamic CT perfusion data〔J〕.AMJN, 2004;25(1):97-107

6沈瑞乐, 王兴萍, 滕军放, 等.丁基苯酞对慢性脑缺血老龄大鼠海马胆碱乙酰基转移酶 mRNA表达的影响〔J〕.郑州大学学报(医学版),2008;43(2):306-8.

7Hall J,Thomas KL,Everitt BJ.Rapid and selective induction of BDNF expression in the hippocampus during contextual learning〔J〕.Nat Neurosci, 2000;3(6):533-5.