创伤性颅脑损伤模型大鼠促红细胞生成素及其受体的表达及意义

李 伟

(铁道警察学院公安技术系,河南 郑州 450053)

创伤性颅脑损伤是危害人类健康及生活质量的常见疾病之一〔1〕。促红细胞生成素(EPO)是一种对神经具有保护以及营养作用的细胞因子，广泛表达在中枢神经系统。近年来研究表明，在外伤所致的颅脑损伤中，EPO及EPD受体(EPOR)的表达与神经保护密切相关〔2,3〕。在缺血缺氧的条件下，EPO的表达显著升高，但EPO、EPOR在疾病中的动态变化仍少见报道。本研究拟探讨EPO、EPOR在脑外伤中的意义。

1 材料与方法

1.1动物模型以及实验分组 由扬州大学实验动物比较医学中心提供的48只SD雄性大鼠，体重为230～250 g，随机分为8组，分别为正常对照组、假手术组、颅脑损伤后2、6、12、24 h、3、7 d组，每组6只。实验组大鼠用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，按照文献方法建立大鼠颅脑损伤模型。假手术组大鼠同样麻醉后手术，但不接受撞击。

1.2标本采集 各组大鼠分别于创伤后2、6、12、24 h、3、7 d处死，假手术组于术后2 d处死，取以损伤灶为中心的脑皮质，直径约为5 mm，于液氮中冻存。

1.3实时定量PCR检测 抽提RNA，设计EPO以及EPOR的引物，进行逆转录，以cDNA为模板进行PCR。PCR条件：50℃ 30 min，95℃ 15 min，94℃ 50 s，58℃ 1 min，72℃ 1 min，共35次循环，72℃终末延伸。β-actin上游引物5′-TCCTATGTGGGTGACGAGGC-3′；上游引物5′-TACATGGCTGGGGTGTTGAA-3′；扩增长度245 bp；Tm值58℃，EPO上游引物5′-ATTTGCGACAGTCGCGTTCT-3′；下游引物5′-GTATCCGCTTGAAGTGTTCG-3′，扩增长度395 bp，Tm值58℃；EPOR上游引物5′-CTATGGCTGTTGCAACGCGA-3′，下游引物5′-CCGAGGGCAGGAGCTTAG-3′，扩增长度402 bp，Tm值58℃。

1.4Western 印迹检测EPO、EPOR的含量 脑组织超声裂解，提取总蛋白，电泳转膜封闭后加入一抗，4℃孵育过夜，加入二抗，于凝胶成像系统下分析，内参照为β-actin，蛋白表达量= 靶蛋白的灰度值/β-actin的灰度值。

2 结 果

2.1Realtime PCR结果 与正常对照组相比，EPO mRNA水平在伤后24 h内升高，第3天达到高峰，至伤后第7天下降；而EPOR从2 h就开始升高，到24 h达到高峰，到损伤后第3天开始下降，但是伤后7 d时仍然维持在较高的水平，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2Western 印迹结果 与正常组相比，创伤性颅脑损伤模型组的EPO在创伤后24 h达到高峰，然后逐渐降低，而EPOR在创伤后早期即大量增加，并在达到高峰后一直维持在较高的水平，见图1、表1。

表1 各组大鼠脑皮质中EPO、EPOR mRNA蛋白表达量

图1 各组大鼠脑皮质EPO、EPOR蛋白Western 印迹图

3 讨 论

在颅脑损伤后存活的患者中，中重度损伤患者几乎都会遗留不同程度的残疾，研究颅脑损伤患者继发性脑损伤的机制、对颅脑损伤患者进行神经保护是近年来研究的重点。大量的研究〔4～6〕表明，外伤对脑的伤害主要是由伤后逐渐发展的继发性脑损伤造成的。颅脑损伤后影响继发性损伤的因素主要有氧化应激、兴奋性氨基酸释放和兴奋毒性损伤、线粒体损伤、细胞内钙离子超载、脑水肿等。

近年来研究发现，EPO可以发挥神经保护作用，EPO与其受体结合可以发挥减轻脑水肿、抑制炎症反应等作用。本研究结果说明在颅脑外伤后，EPO与EPOR的表达均在短时间内显著升高，但是在达到高峰后，EPO的表达开始减弱，而EPOR的表达水平仍维持在较高的水平。这可能与局部的某些细胞因子如白细胞介素-1(IL-1)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)等的表达变化及作用有关〔7〕。文献〔8〕报道，这些炎症因子可以抑制EPO的表达，同时刺激EPOR的表达上调。颅脑损伤后，EPO与其受体表达时间及浓度不一致，EPO的表达具有短暂性和滞后性的特点，提示在颅脑损伤治疗过程中外源性给予EPO的必要性。另外，文献〔9〕也证实外源性的EPO可以通过血脑屏障进入循环系统，进一步证实了颅脑损伤时外源性给予EPO的作用。

综上，创伤性颅脑损伤后，EPO及其受体EPOR表达的时间和浓度不同，在EPOR大量表达时，及时给予外源性的EPO在治疗中可以发挥较理想的神经保护作用，而EPO及其受体的变化以及与局部炎症因子之间的关系尚待进一步研究。

4 参考文献

1朱占胜,吴明灿,张家均,等.创伤性颅脑损伤后白介素-6、18、27变化及临床意义〔J〕.广东医学,2011;32(6):762-3.

2Ponce LL,Navarro JC,Ahmed O,etal. Erythropoietin neuroprotection with traumatic brain injury〔J〕. Pathophysiology,2013;20(1):31-8.

3王 亮.促红细胞生成素与内皮祖细胞在脑损伤中的应用前景〔J〕.国际神经病学神经外科学杂志,2010,37(5):439-42.

4Brines ML,Ghezzi P,Keenan S,etal. Erythropoietin crosses the blood-brain barrier to protect against experimental brain injury〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA,2000;97(19):10526-31.

5Maiese K,Chong ZZ,Hou J,etal. Erythropoietin and oxidative stress〔J〕.Curr Neurovasc Res,2008;5(2):125-42.

6Negre O,Fusil F,Henri A,etal. Activation and inhibition of the erythropoietin receptor by a membrane-anchored erythropoietin〔J〕. Exp Hematol,2008;36(4):412-23.

7李 喆,覃 晓,张江锋,等.大鼠肢体缺血再灌注后不同时相血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平变化及意义〔J〕.广西医学,2012;34(2):172-4.

8Liao ZB,Jiang GY,Tang ZH,etal. Erythropoietin can promote survival of cerebral cells by downregulating Bax gene after traumatic brain injury in rats〔J〕. Neurol India,2009;57(6):722-8.

9Meng Y,Xiong Y,Mahmood A,etal. Dose-dependent neurorestorative effects of delayed treatment of traumatic brain injury with recombinant human erythropoietin in rats〔J〕. J Neurosurg,2011;115(3):550-60.