siRNA干扰碱性成纤维细胞生长因子表达对肺腺癌A549增殖和克隆特性的影响

白小燕 孟又胜 王秀问 王亚伟

(成都市第五人民医院呼吸内科，四川 成都 611130)

肿瘤干细胞理论认为肿瘤干细胞是肿瘤发生和复发的根源，它们具有无限的自我更新、增殖、多潜能分化及抗拒化放疗等特点，针对肿瘤干细胞的治疗才是根本。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在人体正常组织和多种肿瘤广泛表达，bFGF信号通路在肿瘤的发生发展及维持干细胞特性方面起重要作用。因此，本研究应用RNA干扰(RNAi)技术抑制bFGF表达，观察bFGF信号通路对A549的增殖和自我更新等特性的影响。

1 材料与方法

1.1细胞株与试剂 A549细胞系购自中国科学院上海细胞生物研究所；RPMI-1640购自Hyclone公司产品；胎牛血清(FBS)购自TBD公司； bFGF抗体购自SANTA CRUZ公司；β-actin及OCT-4抗体系Abcam公司产品；辣根酶标记山羊抗兔IG购自中杉金桥公司；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量试剂盒均购自碧云天公司；蛋白Marker购自Fermentas公司；ECL发光液购自北京博奥森公司； FGF2-RNA质粒载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司；质粒抽提试剂盒购自北京TIANGEN公司；Nano Fectin转染试剂购自SBI公司；Trizol购自Invitrogen；引物购自上海博尚生物公司。

1.2主要仪器 CO2细胞培养箱(美国Heraus公司)、SWCJ型超净工作台(苏州净化设备公司)、ELx800酶标仪(美国Bio-TEK公司)、倒置显微镜及荧光显微镜(日本Olympus公司)、凝胶分析仪(江苏捷达科技公司)、PTC-200 DNA扩增仪(美国MJ公司)、紫外分光光度计(美国Bekman公司)、低温高速离心机(美国Dupont公司)、台式高速离心机及移液器(德国eppendorf公司)、恒压恒流电泳仪(北京六一仪器厂)。

1.3方法

1.3.1细胞培养 A549细胞置于含10%胎牛血清，青、链霉素各100 U/mL的RPMI-1640培养液中，37 ℃、体积分数为5%的CO2、湿度为100 %的孵箱中培养，每2～3 d传代。

1.3.2bFGF干扰质粒的构建 以bFGF编码基因(GenBank ID:NC_000004)的799～819区域为靶序列，设计siRNA干扰序列： 5′-ACTACAATACTTACCGGTCAA-3′，Loop结构为CTCGAG，命名为pGCsiU6/ puro/GFP-bFGF-siRNA,以无关序列5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′作为阴性对照(NC)，此序列不与任何人类基因序列同源，命名为pGCsiU6/ puro/GFP-NC-siRNA。质粒构建及测通等具体工作由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。

1.3.3质粒转染和细胞分组 转染前1 d制备A549单细胞悬液接种于6孔板，当细胞生长达50%～80%汇合时，按NanoFectinTM说明书步骤分别进行pGCsiU6/puro/GFP-bFGF-siRNA和pGCsiU6/puro/GFP-NC-siRNA质粒转染。转染48 h后，按1∶5传代，细胞贴壁良好后加入1 mg/ml嘌呤霉素进行筛选，2 w后荧光显微镜下挑选多个表达绿色荧光蛋白(GFP)的单一抗性克隆扩增培养，得到稳定表达pGCsiU6/puro/GFP-bFGF-siRNA的A549细胞(干扰质粒组)和稳定表达pGCsiU6/puro/ GFP-NC-siRNA的A549细胞(阴性对照组)。以未转染的A549细胞作为空白对照组。

1.3.4Real-time PCR检测bFGF mRNA表达 引物序列设计：bFGF上游引物为5′-AGTGTGTG CTAACCGTTACCT-3′,下游引物为5′-ACTGCCCAGTTCGTTTCAGTG-3′；以GAPDH为内参对照，上游引物为5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′，下游引物5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′。收集各组细胞，按Trizol说明书提取总RNA，测纯度、浓度。按照PrimeScriptTM反转录试剂盒合成cDNA，反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。然后按SYBR Green反应条件进行实时PCR反应，条件设定为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次，72 ℃再延伸5 min。扩增结束后绘制熔解曲线及扩增曲线，以SDS2.0软件分析Ct值，将各bFGF Ct值减去GAPDH Ct值得ΔCt值，ΔCt越高，mRNA表达越低，以2-△△CT法计算mRNA相对表达量。

1.3.5Western印迹检测OCT-4表达 收集用预冷的PBS洗涤3次的细胞，加适量RIPA及PMSF混合液裂解30 min，4 ℃离心5 min，取上清得细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度。SDS-PAGE:蛋白样品加上样缓冲液混匀，95 ℃ 5 min变性后取50 μg蛋白上样，压缩胶70 V 20 min，浓缩胶100 V 60 min电泳，转膜后，5%脱脂奶粉封闭2 h，加一抗(OCT-4的浓度为1∶800，内参β-actin为1∶1 000)4 ℃过夜，PBST洗膜3次，每次10 min，加二抗(1∶5 000)室温孵育90 min，洗膜后进行ECL法发光、显影、定影。捷达凝胶系统分析各条带积分光密度值(IOD)，以OCT-4的IOD/β-actin的IOD,计算蛋白相对表达量。

1.3.6CCK-8实验检测细胞增殖能力 收集细胞制备细胞悬液，调整细胞浓度为1×104/ml，取100 μl接种7块96孔板，边缘孔以PBS填充，同时设置空白孔(培养基和CCK-8，无细胞)，对照孔(培养基和细胞)，置37 ℃，5%CO2孵育过夜，每孔加入10 μl CCK-8溶液，4 h后测定490 nm各孔的吸光度值(A值)，连测7 d,以时间为横轴，每天的A值为纵轴绘制生长曲线。实验重复3次。

1.3.7克隆形成实验 制备单细胞悬液计数，取100个细胞种于35 mm培养皿中，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养2 w，吸除培养液，甲醇固定15 min，吉姆萨染色液染色10 min，PBS洗涤，于显微镜下计数克隆数并记录。克隆形成率(%)=克隆形成数/接种细胞数×100%。

2 结 果

2.1转染效率的鉴定 转染48 h后用荧光显微镜观察转染效率，大于80%。见图1。

2.2RT-PCR结果 以空白对照组A549细胞的bFGF mRNA表达水平为参照，质粒干扰组及阴性对照组的mRNA相当表达分别为(0.209±0.044)倍及(1.029±0.215)倍，干扰组明显低于阴性及空白对照组(P<0.01)；阴性对照组和空白对照组间差异无统计学意义。

图1 荧光显微镜下观察A549细胞的转染效率

2.3OCT-4蛋白的表达水平 质粒干扰组、阴性对照组和空白对照组OCT-4蛋白相对表达分别为0.440±0.046、0.748±0.102、0.726±0.019，与阴性对照组和空白对照组相比，质粒干扰组的OCT-4蛋白表达明显下降(P<0.01)。见图2。

2.4细胞生长曲线图 第1天各组细胞增殖没有差别，第2～7天质粒干扰组细胞生长明显受抑，增殖活力明显低于阴性对照组和空白对照组(各P<0.01)，阴性对照组和空白对照组间差异无统计学意义。见图3。

1：空白对照；2：阴性对照组；3：质粒干扰组

2.5抑制bFGF表达对细胞克隆形成能力的影响 图中单个紫色小点为一个克隆集落，质粒干扰组、阴性对照组及空白对照组细胞克隆形成率分别为(12.25±2.97)%、(42.75±4.50)%、(44.25±3.31)%，质粒干扰组克隆形成能力明显低于阴性对照组和空白对照组(各P<0.01),而阴性对照组和空白对照组之间差异无统计学意义。见图4。

与质粒转染组比较：1)P<0.05,2)P<0.01

图4 转染后各组A549细胞的克隆集落

3 讨 论

bFGF作为bFGF/FGFR信号通路的关键蛋白，由定位于染色体4q 26～27基因编码，因其上游起始密码子的不同，可产生分子量在18～34 kD之间的多种异构体，这些异构体通过自分泌、旁分泌或者内分泌的形式分泌，与细胞表面的受体接触后通过PKC、Ras /Raf/MEK /ERK、PI3K等途径将信号传递至胞内。

肿瘤的发生、发展很多都和细胞信号通路传导异常密切相关，bFGF/FGFR信号通路作为众多重要信号通路之一，不仅在维持胚胎干细胞〔1〕、骨髓间充质干细胞〔2〕、神经干细胞〔3〕等正常干细胞自我更新、多潜能分化等特性方面起重要作用外，而且在促进肿瘤细胞增殖、侵袭、耐药、抗凋亡及肿瘤新生血管形成等方面起重要作用。已有研究表明，bFGF在脑胶质瘤〔4〕、乳腺癌〔5〕、黑色素瘤〔6〕、肝癌等〔7〕多种肿瘤中过表达。Zhao等〔8〕对肺癌组织及正常肺组织行免疫组化发现，80.9%肺癌组织表达bFGF，明显高于正常肺组织，而且bFGF过表达预示着更差的总生存，说明bFGF在肺癌发生发展中发挥重要作用。

转录因子OCT-4已被证实可作为胚胎干细胞的标志物〔9〕,其在干细胞高表达，一旦干细胞分化，其表达迅速下降或不表达。OCT-4对肿瘤形成及发展也起重要作用，这种作用在乳腺癌〔10〕、肺癌〔11〕、前列腺癌〔12〕、口腔癌〔13〕等肿瘤干细胞中得到证实。Meng等〔14〕研究发现A549细胞系中约有45%的为肿瘤始发细胞，它们具有自我复制、成瘤等特性。Vera等〔15〕对多种人癌细胞系进行化疗药物处理，发现存活细胞富集肿瘤干细胞。本研究检测A549表达OCT-4。

由于bFGF容易变性降解、半衰期极短，限制了bFGF单克隆抗体的使用。而RNA干扰作为一种重要的基因转录后沉默技术，其核心原理是将特异性同源双链RNA导入细胞，导致目的基因不表达或表达下降，由于其不影响DNA的复制和转录，与反义寡核苷酸干扰技术相比，RNAi具有高度特异性、抑制效率高、可持久传代等优点，已广泛应用于基因治疗研究〔16〕。本研究通过RNA干扰可以有效抑制肺癌A549细胞中bFGF在mRNA水平的表达。Greber等〔17〕在人胚胎干细胞中发现bFGF通过调节TGF-β受体信号通路而维持Oct-4、Nanog和Sox2的表达，促进干细胞的自我更新，本研究发现bFGF表达抑制后,A549细胞的增殖能力及自我更新能力降低，,推测可能bFGF被抑制后下调OCT-4表达,影响肺癌A549中的干细胞的特性有关。总之，本研究通过应用RNAi技术，不仅有效抑制肺癌A549细胞中bFGF的表达，而且证明bFGF信号通路被抑制可能通过下调OCT-4，抑制肺癌细胞的增殖及自我更新能力等干细胞特性。

4 参考文献

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