益生菌对肝硬化大鼠肝细胞凋亡的干预作用

李延玲 张怀宏 翟玉峰

(南阳市中心医院，河南 南阳 473000)

肝硬化的发生发展过程中，肠道菌群失衡产生的肠源性内毒素具有重要的作用，两者相辅相成〔1〕。因此，通过调整肠道菌群以改善肝硬化患者的症状、预防肝硬化并发症的发生等成为研究的热点。世界卫生组织把益生菌定义为摄取一定数量后能对机体产生有益作用的微生物〔2〕。益生菌已被用于治疗多种临床疾病。本实验探讨益生菌对肝硬化大鼠肝细胞凋亡的干预作用。

1 材料与方法

1.1材料 健康SD雄性大鼠50只，180～250 g，由浙江中医学大学动物实验中心提供。益生菌(含双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、肠球菌三联活菌)，上海信谊药业有限公司,规格：210 mg/胶囊,含活菌5×107CFU/g(CFU:活菌含量)。四氯化碳(CCl4)，上海申翔化学试剂有限公司；丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、天冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；TUNEL检测试剂盒，兔抗鼠Bax抗体、兔抗鼠Bcl-2抗体、磷酸盐缓冲液均购自武汉博士德生物工程有限公司，PV6003两步法检测试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉公司。高速低温离心机，电热恒温水浴箱(上海医用恒温设备厂)，电子分析天平，玻璃匀浆器。

1.2肝纤维化动物模型的建立 采用橄榄油将CCL4配制成40%油剂，3 ml/kg皮下注射(首次5 ml/kg)，1次/3 d，连续42 d。并饲以高脂低蛋白食物(玉米面混以0.5%胆固醇)，30%酒精为唯一饮料〔3〕。将50只SD大鼠随机分为5组：正常组、模型组、益生菌低、中、高剂量组，每组10只。正常组皮下注射橄榄油2次/w，同时每天予等容量蒸馏水灌胃；模型组在造模同时每天予等容量蒸馏水灌服；益生菌高、中、低剂量组在造模同时每天予以益生菌高剂量(2.10×107CFU)、中剂量(1.05×107CFU)、低剂量(0.53×107CFU)灌胃，末次给药后24 h，股动脉放血处死大鼠，留取血清和部分肝脏组织，进行检测指标测定。

1.3血清肝功能检测 按试剂盒操作说明，使用日立全自动生化分析仪测定大鼠AST、ALT水平变化。

1.4肝组织生化指标测定 取少许肝组织，加入预冷生理盐水匀浆，4 000 r/min，离心10 min，取上清液，根据试剂盒操作说明，检测SOD和MDA活性变化。

1.5肝组织HE染色 取血后处死大鼠，取相同的肝右叶部位，10%甲磷溶醛固定，石蜡包埋，切片，常规HE染色，光镜下观察肝组织的病理学改变。

1.6TUNEL染色检测肝细胞凋亡 石蜡切片常规脱蜡至水后，阻断内源性过氧化酶活性，蛋白酶K修复，滴加TUNEL混合液，标记过氧化酶，DAB显色、复染，脱水透明，中性树胶封片。光镜下观察凋亡细胞，阳性细胞表现为胞核呈棕黄色。每片随机选取5个400倍视野，以阳性细胞所占百分比的平均数为凋亡指数(AI)〔4〕。

1.7Bax、Bcl-2免疫组织化学染色 石蜡切片常规脱蜡至水，用3%H2O2灭活内源性酶10 min,行抗原修复后，分别滴加一抗 (山羊抗鼠Bax/Bcl-2多克隆抗体 )，阴性对照以PBS代替一抗，4℃过夜，滴加通用型二抗，进行DAB显色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以胞质或胞核中出现棕黑色或棕黄色颗粒为阳性细胞。在光镜下每张切片随机选取5个400倍不连续视野，运用图像分析系统测定平均光密度(OD)值，取平均OD值作为测量值。

1.8统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行F检验。

2 结 果

2.1大鼠一般情况 正常组大鼠活动正常，反应灵敏，毛发光泽，体重增长可。其余组大鼠精神萎靡，反应迟钝，活动减少，体重减轻。

2.2各组血清AST、ALT水平的影响 模型组血清中ALT、AST明显高于正常组(P<0.05)，说明造模成功。与模型组相比较，益生菌高、中、低剂量组中ALT、AST水平明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清AST、ALT水平的比较

2.3肝组织中MDA含量、SOD活性的变化 模型组与正常组相比，MDA水平显著升高，SOD水平明显下降(P<0.05)，说明建模成功。与模型组相比较，益生菌低、中、高剂量组中MDA含量显著降低，而SOD含量明显升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肝组织中MDA、SOD水平的比较

2.4各组肝脏病理组织学变化 正常组肝小叶结构完整，肝细胞索呈放射状排列，肝细胞无变性坏死，肝窦、汇管区无扩张淤血，未见炎性细胞浸润。模型组可见肝小叶结构破坏，肝细胞脂肪样变，可见点状、灶状坏死，大量炎性细胞浸润。汇管区及肝实质内可见纤维组织增生，假小叶形成。与模型组相比，益生菌各剂量组肝组织病变有所改善，其中高剂量组改善最为明显，肝细胞水肿明显减轻，肝索结构基本清晰，轻度脂肪样变，部分汇管区少量纤维组织增生，炎性细胞明显减少。

2.5各组肝组织Bax、Bcl-2表达的影响 免疫组化结果显示，正常组可见少量Bax、Bcl-2阳性细胞表达，与正常组比较，模型组中Bcl-2表达降低，Bax表达增强，Bcl-2/Bax明显降低(P<0.05)；而与模型组比较，益生菌各组肝组织中Bcl-2表达增高，Bax的表达较低，Bcl-2/Bax明显增加(P<0.05)。见表3。

2.6各组肝细胞凋亡比较 正常组大鼠肝细胞未见或偶见凋亡细胞；模型组大鼠肝细胞凋亡数量明显增加，呈弥漫性分布；益生菌高、中、低剂量组肝细胞AI(10.19±4.05、15.53±3.16、18.50±4.94)均显著减轻，以高剂量组最为显著；明显高于模型组(28.01±7.42)(P<0.05)，模型组明显高于对照组(1.28±1.38)(P<0.05)。

表3 各组大鼠肝组织Bax、Bcl-2光密度分析结果

3 讨 论

在正常生理情况下，肝脏不仅能清除来自肠道的各种毒素，还能清除肠源性细菌等。但是肝脏功能一旦受损，肠道的微生态即可发生显著变化，导致肠道屏障功能受损，从而肠道细菌及其各种代谢产物将移位进入肠外器官，过度激活机体免疫系统，引起异常免疫反应，导致肝细胞凋亡、坏死。益生菌具有调节机体免疫系统、抑制肠道致病菌感染以及维持胃肠道菌群平衡的作用。已有研究发现益生菌在人的酒精性肝硬化〔5〕，非酒精性脂肪肝类(NASH)〔6〕；鼠的NASH〔7〕模型及半乳糖胺〔8〕或CCl4〔9〕等多种病因所致的肝脏疾病具有一定的治疗作用。

ALT、AST在肝细胞中大量存在，若肝细胞发生坏死，其即可被释放进入血液循环，其浓度水平在一定程度上可反映肝细胞受损程度〔10〕。 MDA是脂质过氧化的最终产物，可破坏细胞膜结构，导致细胞肿胀、变性、坏死和凋亡。而SOD是机体内存在的超氧自由基清除因子，可以修复自由基对肝细胞造成的损害〔11〕。测定MDA、SOD含量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映细胞损伤的程度。本实验结果说明益生菌对肝损伤有一定的保护作用。

凋亡是一种主动性“细胞自杀”的过程，对肝脏疾病的发生发展起着重要的作用〔12〕。研究发现肝细胞凋亡发生时常伴有肝细胞坏死，引发肝损伤，导致肝纤维化〔13〕。Bcl-2和Bax为最主要的凋亡蛋白,其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，它可通过抑制氧自由基、与Bax结合形成杂二聚体、改变胞内细胞器的Ca2+流等而抑制细胞凋亡〔14〕。而Bax作为Bcl-2的同源体，可抑制Bcl-2的作用，促进细胞凋亡〔15〕。当细胞内Bcl-2较多时，Bcl-2和Bax的异源二聚体增多，凋亡趋势减弱；当细胞内Bax较多时，则Bax本身形成的同源二聚体占主导，则易于发生凋亡。Bcl-2/Bax比值对决定细胞是否进入凋亡状态有重要意义〔16～19〕。本实验结果表明Bcl-2、Bax参与了肝纤维化的过程。益生菌能抑制或降低促凋亡蛋白Bax的表达，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而抑制和减轻肝细胞凋亡。益生菌在降低转氨酶，改善肝功能的同时，还能减轻对肝细胞的凋亡，对肝组织起到一定的保护作用。

益生菌作为一种活菌制剂，在治疗肝病的同时正确使用，可保持患者肠道微生态平衡，改善肝功能，提高机体免疫力，保护肝脏损伤，对病情的恢复起到积极的作用。益生菌与人体之间的相互关系和作用机制有待进一步研究。

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