卵巢移植对去势大鼠海马神经元的抗凋亡作用

孔 斌 黑常春 刘 芳 蔡玉芳 朱万平 余建强 王燕蓉 赵承军

(宁夏医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系,宁夏 银川 750004)

雌激素具有保护神经细胞、防止神经退化及抗凋亡的作用。目前临床上应用雌激素替代疗法缓解因雌激素水平低下引发的临床症状，但外源性的雌激素呈非生理性释放，有致癌的副作用，目前卵巢移植不仅使女性癌症患者恢复了生育能力，而且改善女性内分泌平衡，提高患者的生活质量。卵巢移植所获得的内源性雌激素对海马神经元凋亡的影响报道少见，本实验采用去势SD大鼠模型，对比肾被膜下卵巢移植和腹腔注射己烯雌酚观察对大鼠脑海马神经元凋亡的影响变化。

1 材料与方法

1.1材料 一抗为兔抗鼠多克隆Bcl-2、Bax(北京中衫金桥生物技术有限公司)；二抗为辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中彬公司)。水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)，己烯雌酚(上海通用药业股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1动物和分组 选用清洁级健康SD雌性大鼠60只，体重(200 g±20 g)及出生3 d内的SD雌性鼠24只，由宁夏医科大学实验动物中心提供〔合格证SCXK(宁)2005-0001〕；制备去势动物模型后随机分为己烯雌酚组和卵巢移植组，因实验中有动物死亡，故每组各时间点7只。

1.2.2动物模型制备 10%的水合氯醛腹腔注射，动物麻醉后，剪去背部毛发、消毒后，在肋脊角处切开皮肤及肌肉，暴露卵巢，正常对照组只切除卵巢周围脂肪组织，己烯雌酚组及卵巢移植组分享并切除双侧卵巢，然后逐层缝合。己烯雌酚组去势7 d后，隔天腹腔注射己烯雌酚1 mg/kg；卵巢移植组去势7 d后，将出生3 d内SD乳鼠的卵巢移植到肾被膜下。于移植4 d、7 d、14 d和28 d各组动物取血测雌孕激素水平，同时灌注剥离大脑，用于免疫组化。

1.2.3免疫组化 石蜡切片常规脱蜡至脱水。PBS冲洗，抗原修复，3% H2O2室温孵育，以消除内源性过氧化物酶的活性，5%正常山羊血清封闭后，分别滴加Bcl-2、Bax(1∶100)孵育，4℃过夜后，加入二抗辣根酶标记山羊抗兔IgG(1∶100)，DAB显色，脱水，树胶封片，观察照相。

2 结 果

2.1Bax的表达 己烯雌酚组随着给药时间的延长，Bax表达水平在各区表现为缓慢降低趋势，维持在较低的水平，CA3区Bax的表达水平高于CA1和DG二区；卵巢移植组随着移植时间的延长，Bax的表达在各区较同期己烯雌酚组略高，并随移植时间延长，其表达略微有所升高。见表1。

2.2Bcl-2的表达 己烯雌酚组随着给药时间的延长Bcl-2表达水平在各区无明显变化，基本维持在一个水平，同样CA3区Bcl-2的表达水平高于CA1和DG二区；而卵巢移植组随着移植时间的延长，Bcl-2的表达呈明显的上升趋势，尤以移植14 d和28 d明显。移植7 d后Bcl-2的表达水平开始高于同期己烯雌酚组。见表2。

表1 己烯雌酚组和移植组Bax阳性IOD值

表2 两组Bcl-2阳性IOD值

2.3Bcl-2/Bax的比值 己烯雌酚组随给药时间的延长Bcl-2/Bax比值增高缓慢，其中CA1区增加明显，其次为DG区，CA3增加缓慢，不明显。卵巢移植组随移植时间的延长Bcl-2/Bax比值上升非常明显，其中CA1在移植28 d升高更为明显，28 d移植组各区Bcl-2/Bax高于同期己烯雌酚组。

3 讨 论

Bcl-2和Bax是一对功能上相互对立的凋亡调控基因，Bcl-2抑制凋亡，Bax促进凋亡〔1〕。Bcl-2/Bax比值的高低决定着细胞受到刺激后趋于存活还是凋亡〔2〕。么冬爱等〔3〕研究发现给予外源性雌激素，海马神经元可通过降低Bax的表达或升高Bcl-2的表达对抗神经元凋亡，从而对神经元起保护作用。本研究表明给予外源性雌激素可以对抗海马神经元的凋亡。与么冬爱等〔3〕研究结果一致；与阿依木古丽〔4〕应用17β-雌二醇使得去卵巢大鼠海马中Bcl-2蛋白表达上升和Bax蛋白表达下降从而对海马神经元起到保护作用等有所不同。本实验中给予大鼠腹腔注射己烯雌酚仅使得海马神经元Bax的表达下降，Bcl-2的表达不明显，这可能与本实验中用的己烯雌酚不如17β-雌二醇的生物活性强有关。

本研究中，卵巢移植组通过卵巢移植不仅获得了内源性雌激素，同时孕酮水平也较对照组有所提高，卵巢移植的成功还能分泌其他活性因子，这些协同作用于海马神经元不仅使得促凋亡因子Bax的表达下降，同时还使得抗凋亡因子Bcl-2的表达升高，更好更显著的发挥抗凋亡作用。

4 参考文献

1Rarsten R，Freyer D，Karsch M,etal.Erythropoietin is a paracrinemediator of ischemic tolerance in the brain：evidence from an in vitro model〔J〕. Neurosci，2002;22(23)：10291-301.

2Volpe BT，Davis HP，Towle A,etal.Loss of hippocampal CA1 pyramidal neurons correlates with memory impairment in rats with ischemic or neurotoxin lesions〔J〕.Behav Neurosci，1992;106(3)：457-64.

3么冬爱，章军建，张晓琴，等.雌激素对脑缺血时Bcl-2蛋白表达的影响及神经保护作用的研究〔J〕.中国危重病急救医学，2002;14(1)：29-31.

4阿依木古丽.雌激素对去卵巢大鼠大脑皮质和海马中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响〔J〕.中国兽医学报，2009;29(10)：1307-10.