低分子量姬松茸多糖对树突细胞Th1型免疫反应的影响

董海影 张 春 韩翠翠 杨 莹 马立威 牛英才 刘吉成

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 151100)

目前，免疫治疗成为了肿瘤治疗的新方向。研究表明〔1〕，姬松茸多糖(LMPAB)既可直接作用于肿瘤细胞或诱导肿瘤细胞凋亡，也可通过增强宿主免疫力而发挥抗肿瘤作用。本课题组长期从事LMPAB抗肿瘤的研究，发现其可通过增强宿主的免疫功能而发挥抗肿瘤作用，如促进树突细胞(DCs)成熟、激活巨噬细胞、活化T、B淋巴细胞、提高自然杀伤(NK)细胞、淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞等细胞活性，证明其可能具有免疫佐剂的作用〔2〕。本研究主要探讨低分子量LMPAB对 DCs Th1型免疫反应的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药物 LMPAB由齐齐哈尔医学院医药科学研究所分离提取，分子量约为48 000。卵白蛋白(OVA)和β-葡聚糖均由Sigma公司提供。

1.1.2动物 ICR雄性小鼠，6～8周龄，SPF 级，由吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供，许可证编号：SCXK (吉)2007-0003。

1.1.3试剂与仪器 白细胞介素-4(IL-4)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子(TNF)-α(RD公司)，WST(Millipore公司)，RPMI1640培养液与胎牛血清(Hyclone公司)。MR1812高速冷冻离心机为法国Jouan产品，MDF-492超低温冰箱为日本三洋公司产品，AE-240型电子天平为梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1DCs的获取 断髓处死小鼠，75%酒精浸泡10 min，解剖取出小鼠股骨和胫骨，75%酒精浸泡3～5 min，磷酸盐缓冲液(PBS)液冲洗骨髓至苍白，200目筛网两层过滤，离心去上清，加入红细胞裂解缓冲液2 min，加入10 ml RPMI1640培养液离心去上清，加RPMI1640制成单细胞悬液，加入GM-CSF、IL-4和完全培养液CM 5 ml，在37℃ 5%CO2的条件下培养6～8 d，期间隔天半量换液，同时加入IL-4、GM-CSF。

1.2.2WST检测细胞增殖 用RPMI1640完全培养液将DC制成单细胞悬液，将DC接种于96孔板，100 μl/孔、1×104个细胞/孔，然后分别加入LMPAB 5、10、20 μg/ml、OVA、β-葡聚糖+OVA和不含药物培养液各100 μl，每孔四个平行孔，5%CO2、37℃下培养44 h，加入WST-1 10 μl/孔，继续培养4 h，检测OD值。

1.2.3酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-12与γ-干扰素(IFN-γ) 吸取DC的培养液上清，按照试剂盒要求检测IL-12与IFN-γ水平。

2 结 果

2.1WST检测DC对T淋巴细胞的增殖作用 见表1。

表1 WST检测DC对T淋巴细胞的增殖作用

2.2ELISA方法检测LMPAB对DC的Th1型免疫反应的影响 见表2。

表2 各组DC分泌IFN-γ与IL-12水平比较

3 讨 论

临床实践证明，免疫治疗抗肿瘤疗效显著，可有效遏制肿瘤的发展，延长患者的生命。同时研究发现，应用免疫佐剂可以提高肿瘤免疫治疗的效果。癌症患者因T细胞与NK 细胞功能不全，呈现肿瘤免疫抑制，进而妨碍肿瘤的免疫治疗，影响其疗效。免疫佐剂具有抗原载体功能，激活和增强抗原呈递细胞(APC)的抗原递呈功能，因此，免疫佐剂的应用将成为肿瘤免疫治疗的新方向。而中草药抗肿瘤作用具有多靶点、多环节、多效应的特点，可作用于肿瘤发生、发展的多个环节，同时具有毒副作用低，能提高机体免疫力，不易产生耐药性的优势，因此，天然植物中寻找抗肿瘤药物是最重要的捷径和手段。研究证明〔3〕，姬松茸的抗肿瘤作用疗效显著，是抗肿瘤大型蕈菌的代表菌属，并且还具有用量少、作用明显等特点，而其抗肿瘤的活性成分主要是多糖。前期研究表明〔4,5〕，LMPAB可以增强宿主免疫功能而发挥抗肿瘤作用，同时，LMPAB对DCs的成熟具有一定的影响〔6,7〕。DCs是体内最有效的专职抗原递呈细胞，能够激活初始型T细胞，并使其增殖，是启动、调控并维持特异性免疫应答的中心环节〔8〕，是机体抵御恶性肿瘤的重要防御者。本次实验结果表明，LMPAB 可以增强DCs对T淋巴细胞的增殖作用，可以增强DCs的生物学功能，IFN-γ属于Ⅱ型干扰素，主要由活化的T细胞和NK细胞产生，在机体细胞免疫和体液免疫中发挥着重要的作用〔9〕，成熟的DCs可分泌大量的IL-12、IFN-γ和TNF-α等细胞因子，而IFN-γ也可以促进DCs的成熟，进而增强DC的杀伤活性〔10〕，而IL-12分泌量取决于DCs的成熟状态〔11〕，IL-12是Th1型免疫反应中最重要的细胞因子，促进Th1型免疫细胞的分化，启动特异性T淋巴细胞反应并抑制Th2型免疫细胞的生成，在抗感染、抗肿瘤免疫反应中起举足轻重的作用〔12〕，IL-12与IFN-γ两者含量的增加可以增强DCs的生物学功能。本研究进一步阐明LMPAB的抗肿瘤机制，为临床应用提供理论支持和帮助。

4 参考文献

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2牛英才，赵学梅，张 春.低分子量姬松茸多糖对小鼠S180肉瘤的抑制作用及其机制〔J〕.肿瘤防治研究，2009；36(3):180-2.

3Firenzuoli F,Gori L,Lombardo G. The medicinal mushroom agaricus blazei murrill:review of literature and pharmaco -toxicological problems〔J〕. Evid Based Complement Alternat Med,2008;5(1):3- 15.

4Kasai H,He LM,Kawamura M,etal.IL-12 production induced by agaricus blazei fraction H (ABH) involves toll-like receptor (TLR)〔J〕. Evid Based Complement Alternate Med,2004;11(3):259-67.

5崔红霞,苏富琴,赵学梅.姬松茸多糖抗肿瘤作用研究〔J〕.中药药理与临床,2006；22(2):27.

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9Pflanz S,Hibbert L,Mattson J,etal. WSX-1 and glycoprotein 130 constitute a signal-transducing receptor for IL-27〔J〕. J Immunol,2004;172(4):2225-31.

10Wittmann M,Zeitvogel J,Wang D,etal. IL-27 is expressed in chronic human eczematous skin lesionsand stimulates human keratinocytes〔J〕. J Allergy Clin Immunol,2009;124(1):81-9.

11Saito F,Ohno Y,Morisawa K,etal. Role of IL-27-producing dendritic 〔corrected〕cells in Th1-immunity polarization in lewis rats〔J〕. Biochem Biophys Res Commun,2005;338(4):1773-8.

12Zahn S,Wirtz S,Birkenbach M,etal. Impaired Th1 responses in micdefficient in epstein-barrvirus-induced gene 3 and challenged with physiological doses of Leishmania major〔J〕. Eur J Jmmunol,2005;35(4):1106-12.