乳腺小黏蛋白基因在检测乳腺癌病人外周血微转移中的应用价值

刘平贤

(南阳市中心医院乳腺分泌腺外科，河南 南阳 473000)

我国乳腺癌的发病率约占妇女肿瘤三分之一, 而且具有较高的死亡率〔1〕。远处转移是造成乳腺癌病人死亡的主要原因。乳腺癌的转移模式并非固定不变的,早期乳腺癌亦有隐匿性转移〔2〕。故早期检测外周血微转移对该病的有效治疗及评判预后意义重大。本文以乳腺小黏蛋白(SBEM)基因作为检测指标, 分析乳腺癌病人外周血中的循环肿瘤细胞及其在微转移检测中的应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 本院2011年2月至2012年11月111例乳腺癌病人外周血标本。年龄30～79岁, 平均(46.4±16.5)岁。根据乳腺癌组织学类型划分: 99例浸润性导管癌, 7例浸润性小叶癌, 4例黏液癌, 1例单纯癌。TNM分期情况: 21例Ⅰ期, 75例Ⅱ期, 15例Ⅲ期。孕激素受体(PR)阳性及阴性分别为46例与65例; 雌激素受体(ER)阳性及阴性分别为69例与42例。此外，对照组选择18例女性结/直肠癌、24例女性胃癌、42例女性乳腺纤维腺瘤病人以及29例女性健康志愿者的外周血标本。全部病人均通过临床病理学确诊, 乳腺癌病人术前胸片X线检查、CT、B超以及骨扫描等未见转移灶。

1.2仪器与耗材 聚合酶链反应(PCR)仪为美国PE公司生产; 凝胶成像仪为美国Bio-Rad公司生产; 分光光度计为上海第二分析仪器公司生产; 淋巴细胞分离液购自天津TBD公司; 核酸提取及逆转录(RT)-PCR试剂盒均购自Promega公司; Taq DNA聚合酶购自MBI公司; 核酸染料EB购自华美公司; DNA 分子量标记购自Sangon公司。

1.3引物设计 应用Primer5.0软件设计引物, 合成工作委托上海生工完成。SBEM mRNA首轮PCR左引物序列: 5′-TAGCAGTCCTGGTACTCTTGG-3′; 右引物序列: 5′-AGCTGATTCCATCTCAGGGAC-3′, PCR产物长度为276 bp; 第二轮PCR左引物序列: 5′-TGCCCAGAATCCGACAACA-3′; 右引物序列: 5′-GCAGTGGTCGCAGTGGTTG-3′, PCR产物长度为114 bp。

1.4收集标本及核酸提取 全部病人采血前均未实施辅助治疗。采5 ml外周血, 通过EDTA抗凝处理, 淋巴细胞分离液获得单个核细胞。根据试剂盒步骤在0.5 h内抽提组织总RNA。分光光度计检测RNA的纯度, 琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否降解。

1.5RT-PCR扩增 根据RT-PCR试剂盒说明书步骤实施基因扩增。RT-PCR总反应体系为20 μl, 包括AMV反转录酶0.7 μl, mRNA模板2 μl, MgCl2(25 mmol/L)4 μl, dNTPs 2 μl, 10×缓冲液 2 μl, 核酸酶抑制剂0.5 μl, Oligo(dT) 151 μl, 去核酶水7.8 μl。在42℃条件下逆转录15 min; 逆转录酶在95℃下热变性5 min。首轮PCR总反应体系为25 μl, 包括cDNA 1 μl, 10×缓冲液 2.5 μl, MgCl2(25 mmol/L) 2 μl, DNA聚合酶0. 2 μl, dNTPs 0.5 μl, 左、右引物各为1 μl, 去核酶水16.8 μl。循环条件为预变性94℃, 4 min; 共32次循环扩增, 94℃, 45 s变性; 54℃, 45 s退火; 72℃, 60 s延伸, 最后延伸72℃ 5 min。第二轮PCR取首轮PCR产物1 μl作为扩增模板, 加第二轮PCR左、右引物各1 μl。扩增条件为94℃预变性 5 min; 共32次循环扩增, 94℃, 45 s变性; 57℃, 45 s退火; 72℃, 60 s延伸, 最终72℃延伸10 min。使用100 bp DNA 梯度作为分子量标记, 在浓度为2%的琼脂糖凝胶中电泳,在紫外光下观察并记录结果。

1.6统计学分析 应用SPSS18.0软件进行χ2检验。

2 结 果

2.1测序结果 所扩增的SBEM基因片段序列提交GeneBank数据库并通过BLAST程序，进行同源性比对后证实所得产物即为SBEM基因的部分序列。

2.2外周血中SBEM基因的表达情况 乳腺癌组外周血阳性表达率〔53.15%(59例)〕与乳腺纤维腺瘤组(0)、健康组(0)、胃癌组(0)和结直肠癌组(0)相比差异显著(P<0.05)。见图1。

2.3SBEM基因阳性表达与乳腺癌病理学特征的相关性 SBEM基因的阳性表达与病人淋巴结转移以及TNM分期之间具有相关性(P<0.01); 而与病人年龄大小、病理类型、原发肿瘤体积、ER以及PR等无相关性(P>0.05)。见表1。

表1 SBEM基因在乳腺癌外周血的阳性表达及病理学特征的相关性〔n(%)〕

3 讨 论

目前我国乳腺癌的发病率在女性恶性肿瘤中居首位〔3〕。文献报道称乳腺癌发病早期即存在微转移〔4，5〕。血液循环系统中的癌细胞是造成肿瘤转移及复发的主要诱因, 故而尽早查出外周血中的肿瘤细胞不但对防范复发及转移有重大潜在价值, 而且对肿瘤病人的临床治疗意义重大。

关于乳腺癌微转移检测, 尚无灵敏度高的分子标记。故选用特异性高的指标基因是确保微转移检测结果可靠性的关键所在〔6〕。SBEM的基因定位在染色体12q上, 它由3条8个氨基酸的短肽前后重复的疏水核心构成, 与唾液黏蛋白结构相似。SBEM基因的表达呈现出明显的特异性, 仅表达于乳腺及唾液腺中, 具有高度的特异性, 特别适用于检测乳腺癌微转移, 提倡作为早期诊断乳腺癌的分子标记。

RT-PCR具有较高的敏感度, 可在1×106～1×107个正常细胞中分辨出一个肿瘤细胞〔7〕。在外周血中肿瘤细胞检测方面, RT-PCR能够扩增出肿瘤细胞中标志性的靶基因来说明外周血中存在肿瘤细胞, 已被普遍应用于检测各种实体瘤微转移〔8〕。本研究因存在大量RNA酶, 血浆中无游离的mRNA, 故经RT-PCR方法检测出的SBEM mRNA必然源于外周血中完整的循环细胞, 而且正常乳腺细胞以及乳腺良性肿瘤细胞是不能进入外周循环的, 而乳腺癌细胞外则可以进入外周循环, 故SBEM mRNA阳性则提示血液循环中存在乳腺癌细胞〔9〕。

本研究说明SBEM基因在检测乳腺癌外周血循环肿瘤细胞方面的特异性较高。SBEM基因表达的阳性率随TNM分期呈正相关。这与恶性肿瘤细胞的生物学行为相一致。此外，本研究表明Ⅰ及Ⅱ期乳腺癌病人可能存在血循环微转移现象。不是全部乳腺癌病人外周血中均可检测出SBEM mRNA表达。这表明肿瘤细胞是成簇且不连续地进入血液循环中的, 故增加取血次数及一次取血量将增大阳性率。腋窝淋巴结状态是乳腺癌预后的重要指标。

总之，外周血中SBEM mRNA表达的阳性率在某种程度上可以反映出临床病期, 对指导临床治疗以及评判预后具有重要价值，但仍需对病人进行长期随访, 以明确微转移与复发、转移以及预后之间的相关性。

4 参考文献

1张嘉庆, 王 殊, 乔新民. 乳腺癌的现状与远景〔J〕.中华外科杂志, 2002;40(3): 161-3.

2Masago K,Fujita S,Kim YH,etal.Effect of vascular endothelial growth factor polymorphisms on survival in advanced-stage non-small cell lung cancer〔J〕. Cancer Sci, 2012; 100(10):1917-22.

3Abdollahi A, Hlatky L, Huber PE,etal. The logic of antiangiogenic therapy〔J〕. Drug Resist Update, 2009; 8(1): 59-74.

4Grunewald K, Haun M, Urbanek M,etal. Mamma globin gene express: a superior marker of breast cancer cells in peripheral blood in comparison to epidermal growth-factor receptor and cytokeratin-19〔J〕. Lab Invest, 2000; 80: 1071-7.

5刘少杰, 裴小娟, 彭伟强, 等. 乳腺组织中凋亡抑制蛋白Survivin的表达差异及意义〔J〕. 汕头大学医学院学报, 2012; 25(2): 110-1.

6李文广, 颜 海, 张燕妮, 等. 乳腺癌组织ezrin、nm223和VEGF的表达及临床意义〔J〕. 江苏医药, 2010; 36(4): 387-9.

7Xu WG, Liu Y, Wang G,etal. Expression and clinical significance of vascular endothelial growth factor in benign and malignant tissues of breast〔J〕. Chin J Cancer Res, 2008; 20(4): 290-3.

8Ganggaiswari A, Kresno SB, Krisnuhoni E. VEGF expression and desmoplastic reaction as potential progressive factors in young patients with colorectal cancer〔J〕. Acta Med Indones, 2010; 42(1): 6-11.

9李颖嘉, 孙学刚, 文 戈. 乳腺癌及癌前病变血管生成相关分子的表达及意义〔J〕. 中国组织化学与细胞化学杂志, 2011l;18(3): 316-21.