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天麻素在铁诱导的大鼠离体心肌损伤中的保护作用

2014-09-12马会浩何白云陈欢俊张永星汪博泉

中国老年学杂志 2014年7期
关键词:离体过氧化灌流

马会浩 周 敏 何白云 陈欢俊 刘 惠 张永星 汪博泉

(三峡大学医学院,湖北 宜昌 443002)

近年研究发现:天麻素具有镇静、镇痛、抗惊厥、抗癫痫,改善脑血流量不足;能抑制心肌细胞生物膜的脂质过氧化作用,促进心肌细胞能量代谢,对心肌缺血再灌注(I/R)的损伤有显著的保护作用〔1〕。实验证实,心肌缺血后心肌细胞内铁含量急剧增加,约为正常时的27倍,为I/R损伤的主要原因之一〔2〕。本实验探讨天麻素在铁诱导的心肌损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物和试剂 雄性SD大鼠(250~300 g)由三峡大学实验动物中心提供〔编号:SCXK(鄂)2011-0012〕。天麻素购于中国药品生物制品鉴定局;乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)均购于南京建成生物工程研究所;FeCl3·6H2O和8-羟基喹啉(8-HQ)均购于Sigma公司;其他化学药品均为国产分析纯。使用前,将FeCl3·6H2O和8-HQ按1∶2的比例混合,形成脂溶性复合物Fe-HQ。

1.2实验仪器 8道多功能生理记录仪(BLOPAC Systems MP150)生物信号采集系统。

1.3实验分组 雄性SD大鼠随机分成4组,每组8只大鼠,每只大鼠总计灌流时间为90 min。各组心脏用K-H液灌流30 min平衡后,再分别进行如下操作:正常组,继续灌流K-H液60 min;Fe-HQ组,持续灌流K-H液30 min,再灌Fe-HQ(5 μmol/L)10 min,复灌K-H液20 min;天麻素(0.1 mmol/L)组,天麻素(0.1 mmol/L)灌流30 min,再灌Fe-HQ(5 μmol/L)10 min,复灌K-H液20 min;天麻素(0.025 mmol/L)组,天麻素(0.025 mmol/L)灌流30 min,再灌Fe-HQ(5 μmol/L)10 min,复灌K-H液20 min。

1.4Langendorff灌流大鼠离体心脏和心功能指标的测定 雄性SD大鼠麻醉后,迅速取出心脏置于4℃ Krebs-Henseleit溶液(K-H液)中,剪去周围多余结缔组织,固定在Langendorff灌流装置上,恒温(37.0℃)恒压(90 cmH2O)灌流。K-H液成分:118 mmol/L氯化钠(NaCl), 4.7 mmol/L氯化钾(KCl),2.5 mmol/L CaCl2,1.2 mmol/L硫酸镁(MgSO4),1.2 mmol/L(KH2PO4),11 mmol/L葡萄糖(Glu),25 mmol/L碳酸氢钠(NaHCO3),pH 7.35~7.45,持续通入混合气体〔95%氧(O2)和5%二氧化碳(CO2)〕。采用左室内水囊传递压力测定心室内压,观察和记录心率(HR)、左室收缩压(LVSP)、dp/dt max和冠脉流量(CF)各项心功能指标。

1.5心肌损伤和脂质过氧化指标的测定 待大鼠心功能稳定后,每5 min测量1次CF,并用试剂盒测定最后一次的冠脉流出液中的LDH和CK的含量。实验结束后,测定心室肌组织中的MDA浓度。

1.6心肌组织超微结构的观察 实验结束后,取心肌组织(厚约3 mm),经戊二醛固定,用以电镜切片。

1.7统计学方法 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1天麻素对铁诱导的大鼠心功能的影响 Fe-HQ组:HR、dp/dt max、CF均明显降低,复灌K-H液后不能恢复;LVSP在灌Fe-HQ时有明显的降低,复灌5 min时快速反转至接近正常水平再迅速下降。天麻素(0.1、0.025 mmol/L)组对铁诱导的心肌的HR、LVSP、dp/dt max、CF的下降均有抑制作用,且K-H液复灌后保持稳定。见图1。

与Fe-HQ组比较:1)P<0.05,2)P<0.01

2.2天麻素对铁诱导的大鼠离体心脏的LDH、CK和MDA的影响 Fe-HQ组,冠脉流出液中的LDH和CK的含量及MDA的浓度,较正常组、天麻素(0.1、0.025 mmol/L)组显著增加(P<0.05)。见表1。

2.3对心肌超微结构的影响 Fe-HQ组心肌肌纤维疏松,线粒体肿胀,嵴减少,甚至出现空泡和部分线粒体崩解。而天麻素(0.1、0.025 mmol/L)组的肌膜平直、均匀、完整,心肌肌丝排列有序整齐,肌节界限清楚,Z线、M线、I带、A带、H带清晰可见,线粒体嵴致密,清晰。在电镜40万倍下观察,天麻素0.1 mmol/L组较0.025 mmol/L组的心肌组织整体状态更好。见图2。

表1 天麻素对铁诱导的大鼠离体心脏的LDH和CK的含量及MDA的浓度的影响

图2 各组大鼠心肌超微结构 (×200 000)

3 讨 论

Fe-HQ可促进Fe3+跨膜转运入心肌细胞内,并阻止铁重新转运出细胞,从而增加了心肌细胞内的Fe3+的浓度。而单纯的8-HQ对心脏的各项指标均无明显的改变〔3〕。因此可以用Fe-HQ灌流心脏制备铁诱导心肌损伤模型。

实验结果显示,Fe-HQ能显著降低HR、dp/dt max、CF,复灌K-H液后,不能恢复,与文献报道相似〔4〕。Fe-HQ灌流引起心肌细胞内Fe3+浓度显著提高,对心肌有毒性作用,造成心肌收缩功能的降低,这种病理改变主要有:Fe3+攻击心肌细胞,与富含巯基的蛋白质作用〔5〕,造成细胞内与收缩相关的酶失活,致使心肌电及收缩功能的异常〔4〕;同时铁抑制肌浆网RYR受体的结合性,导致外钙内流诱发的内钙释放的减少〔6〕;因内钙释放的减少导致心肌收缩能力的降低。本研究结果提示天麻素对铁诱导的大鼠离体心脏功能损伤有保护作用。

实验结果显示高浓度的Fe3+能使灌流液中的·OH含量增高〔7〕;Fe3+-HQ易被细胞内的还原物质所还原,而在有氧情况下,Fe2+-HQ可被快速氧化〔8〕;因此Fe-HQ在心肌细胞内易发生还原氧化反应,产生氧自由基,对心肌产生毒性作用。心肌组织中的MDA含量间接反映了组织中氧自由基的变化,反映心肌组织脂质过氧化程度。冠脉流出液中,心肌损伤的标志性酶LDH和CK的释放量也能反映心肌的损伤程度。天麻素预灌后,能有效改善Fe-HQ灌流引起的心肌脂质过氧化程度。本研究结果提示天麻素可能是通过减轻生物膜的脂质过氧化作用,拮抗Fe-HQ的脂质过氧化损伤,对心肌起保护作用。

4 参考文献

1周 敏,陆永利,郑世玲,等.天麻素抗离体心肌缺血/再灌注损伤的作用〔J〕.辽宁中医药大学学报,2009;12(12):80-2.

2Voogd A,Sluiter W,van Eijk HG,etal. Low molecular weight iron and the oxygen paradox in isolated rat hearts〔J〕. J Clin Invest,1992;90:2050-5.

3陈莹莹,夏 强,曹春梅,等.一氧化氮在铁诱导的大鼠心肌损伤中的作用〔J〕.生理学报,2002;54(4):300-6.

4陈莹莹,曹春梅,徐万红,等.铁负荷对离体大鼠心脏和分离心室肌细胞的作用〔J〕.中国病理生理杂志,2002;18(8):985-7.

5Korge P,Campbell KB. Iron effects on myocardial enzymes depend on redox state〔J〕. J Mol Cell Cardiol,1994;26(2):151-62.

6Kim E,Ciri SN,Pessah IN. Iron(Ⅱ) is modulator of ryanodine-sensitive calcium channels of cardiac muscle sarcoplasmic reticulum〔J〕. Toxicol Appl Pharmacol,1995;130:57-66.

7Oubidar M,Marie C,Mossiat C,etal. Effects of increasing intracellular reactive iron level on cardiac function and oxidative injury in the isolated rat heart〔J〕. J Mol Cell Cardiol,1996;28(8):1769-76.

8Oubidar M,Boquillon M,Marie C,etal. Effect of intracellular iron loading on lipid peroxidation of brain slices〔J〕. Free Radic Biol Med,1996;21:763-9.

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